本文選題：白楊素　切入點：胰腺癌　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分白楊素抑制胰腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)其線粒體途徑凋亡目的研究黃酮類化合物白楊素對人胰腺癌細胞增殖、凋亡等的影響及其可能的機制。方法細胞增殖活性采用CCK-8法和克隆平板試驗檢測：細胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)流式細胞術(shù)檢測；細胞周期采用PI單標(biāo)流式細胞術(shù)檢測；免疫印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果白楊素能抑制胰腺癌細胞增殖和克隆形成,且這種作用呈時間和濃度依賴性；白楊素能阻滯細胞周期于G0/G1期,并誘導(dǎo)胰腺癌細胞發(fā)生凋亡；免疫印跡結(jié)果顯示,白楊素能引起PARP、Caspase-9、Caspase-3剪切體的激活,同時上調(diào)Bax/Bcl-2的比值。結(jié)論白楊素能抑制人胰腺癌細胞增殖和克隆形成能力,并阻滯細胞周期于G0/G1期；白楊素能夠誘導(dǎo)胰腺癌細胞發(fā)生線粒體途徑凋亡。第二部分白楊素通過抑制溶酶體酶活性阻斷胰腺癌細胞自噬目的研究白楊素對人胰腺癌細胞自噬的影響及其可能的機制。方法構(gòu)建攜帶GFP標(biāo)簽的LC3過表達慢病毒載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株,激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)GFP-LC3點狀聚集的數(shù)目：免疫印跡法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達情況：免疫熒光法檢測自噬底物p62蛋白的表達;采用透射電子顯微鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的變化；構(gòu)建攜帶GFP和mRPF雙標(biāo)簽的LC3過表達慢病毒載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株,激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)GFP-LC3和mRFP-LC3共定位關(guān)系;利用溶酶體探針LysoTracker Red檢測溶酶體與GFP-LC3之間的空間定位關(guān)系；采用AO(吖啶橙)染色觀察細胞內(nèi)酸性自噬泡的數(shù)目；采用組織蛋白酶活性測定試劑盒檢測細胞內(nèi)組織蛋白酶的活性情況。結(jié)果共聚焦結(jié)果顯示,白楊素能導(dǎo)致穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-LC3過表達慢病毒的胰腺癌細胞內(nèi)出現(xiàn)大量GFP-LC3點狀聚集,且這種作用呈濃度和時間依賴性;同時,這種GFP-LC3綠色熒光與LysoTracker Red紅色熒光具有共定位關(guān)系：免疫印跡和免疫熒光結(jié)果顯示,白楊素可誘導(dǎo)胰腺癌細胞自噬關(guān)鍵蛋白LC3-II的表達增加,而自噬底物蛋白p62表達也增加；電鏡結(jié)果顯示,白楊素能誘導(dǎo)胰腺癌細胞胞質(zhì)內(nèi)形成大量自噬泡；免疫印跡結(jié)果顯示,溶酶體抑制劑CQ與白楊素聯(lián)合作用后,LC3-II的表達較單用CQ組無明顯增加；與CQ作用相似,白楊素能誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GFP-mRPF-LC3過表達慢病毒的胰腺癌細胞內(nèi)GFP-LC3和mRFP-LC3熒光共定位,而自噬激活劑Rap作用后mRFP-LC3熒光顯著高于GFP-LC3;AO染色結(jié)果顯示,白楊素與CQ均能顯著增加胰腺癌細胞內(nèi)酸性自噬泡的數(shù)量；組織蛋白酶活性檢測和免疫印跡結(jié)果顯示,白楊素能抑制胰腺癌細胞內(nèi)組織蛋白酶B和組織蛋白酶D的活性。結(jié)論白楊素通過抑制溶酶體酶活性阻斷胰腺癌細胞自噬。第三部分白楊素通過抑制自噬增強胰腺癌細胞對吉西他濱化療敏感性目的探討白楊素聯(lián)合吉西他濱對胰腺癌細胞增殖、凋亡的影響及其機制。方法細胞增殖活性采用CCK-8法檢測；細胞凋亡采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)流式細胞術(shù)檢測;倒置顯微鏡觀察藥物單用或聯(lián)用對細胞形態(tài)的影響；免疫印跡法檢測自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達;采用RNAi技術(shù)沉默自噬關(guān)鍵基因Beclin1、ATG5、ATG7后檢測吉西他濱對胰腺癌細胞增殖、凋亡作用的變化。結(jié)果吉西他濱能通過濃度和時間依賴性方式部分抑制胰腺癌細胞增殖;免疫印跡結(jié)果顯示,吉西他濱可誘導(dǎo)胰腺癌細胞LC3-Ⅱ的表達增加,而自噬底物蛋白p62則表達減少；吉西他濱與溶酶體抑制劑CQ合用后,LC3-Ⅱ的表達較單用CQ顯著增加；無論是聯(lián)合自噬抑制劑CQ或是沉默自噬關(guān)鍵基因Beclin1、ATG5、ATG7后,均能顯著增加吉西他濱對胰腺癌細胞的殺傷效果；當(dāng)吉西他濱與白楊素聯(lián)合使用后,LC3-Ⅱ的表達較二者單用顯著增加；同時,兩藥聯(lián)用較單藥使用更能抑制胰腺癌細胞活性并誘導(dǎo)細胞凋亡,而在聯(lián)用基礎(chǔ)上加入CQ后并未增加細胞殺傷效果；免疫印跡結(jié)果顯示,兩藥聯(lián)用較單藥使用更能增加PARP、Caspase-9、Caspase-3剪切體的激活,并進一步上調(diào)Bax/Bcl-2的比值。結(jié)論吉西他濱部分抑制胰腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞發(fā)生保護性自噬：白楊素通過抑制自噬增強胰腺癌細胞對吉西他濱的化療敏感性。
[Abstract]:The first part of chrysin inhibits the proliferation of pancreatic cancer cells and on human pancreatic cancer cell proliferation and induce the apoptosis of mitochondrial pathway of flavonoids in poplar, apoptosis and its possible mechanism. The activity of cell proliferation by CCK-8 method and plate cloning test: cell apoptosis by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry; cells cycle using PI single labeled flow cytometry; detect the expression of apoptosis related proteins by Western blotting. Results of chrysin can inhibit pancreatic cancer cell proliferation and colony formation, and this effect was time and dose-dependent; chrysin can block the cell cycle in G0/G1 phase, and induced apoptosis of pancreatic cancer cells; Western blot the results show that chrysin can cause PARP, Caspase-9, activation of Caspase-3 shear body, while raising the ratio of Bax/Bcl-2. Conclusion chrysin inhibits The proliferation of human pancreatic cancer cells and cloning formation ability and cell cycle arrest in G0/G1 phase; chrysin can induce pancreatic cancer cell apoptosis of mitochondrial pathway. The second part chrysin by blocking the effects of pancreatic cancer cell autophagy objective of chrysin on autophagy in human pancreatic adenocarcinoma cells inhibit the activity of lysosomal enzyme and its possible mechanisms. Methods of construction with GFP tag LC3 overexpression lentivirus vector and stably transfected into pancreatic cancer cell line, observe the number of intracellular GFP-LC3 punctate aggregation of laser confocal microscopy: to detect the expression of autophagy related protein by Western blotting to detect the expression of p62 protein: autophagy substrates immunofluorescence; the changes of ultrastructure were observed by transmission electron microscope; construct GFP and mRPF double labeling of LC3 overexpression lentivirus vector and stably transfected into pancreatic cancer cell line, confocal laser display Micro mirror observation of intracellular GFP-LC3 and mRFP-LC3 Co located; using spatial location relationship between probe LysoTracker Red detection of lysosomes and lysosomal GFP-LC3; using AO (acridine orange) staining was used to observe the number of intracellular acidic autophagic vacuoles; the cathepsin activity determination kit for detecting intracellular cathepsin activity. The results of confocal results show that chrysin can lead to the emergence of pancreatic cancer cells transfected with GFP-LC3 overexpression lentivirus in GFP-LC3 punctate aggregation, and this effect is dose and time dependent; at the same time, the GFP-LC3 green fluorescence and LysoTracker Red red fluorescence with CO localization between Western blotting and immunofluorescence results showed that increased expression of chrysin induced pancreatic cancer autophagy protein LC3-II, and p62 also increased the expression of autophagy protein substrate; electron microscopy showed that chrysin Can induce pancreatic cancer cells in the cytoplasm of the formation of a large number of autophagic vacuoles; Western blotting showed that the lysosomal inhibitor CQ and the combined effect of chrysin, the expression of LC3-II was no significant increase in CQ group; similar to the CQ effect of chrysin induced pancreatic cancer cell can be stably transfected with lentivirus expressing GFP-mRPF-LC3 in GFP-LC3 and mRFP-LC3 fluorescence co localization, and activate autophagy after Rap mRFP-LC3 fluorescence was significantly higher than that of GFP-LC3; AO staining showed that chrysin and CQ significantly increased the number of pancreatic cancer cells in acidic autophagic vacuoles; cathepsin activity test and Western blotting showed that chrysin inhibits pancreatic cancer cells, cathepsin B and cathepsin D conclusion chrysin. Activity by inhibiting the activity of lysosomal enzyme blocking autophagy in pancreatic cancer cells. The third part of chrysin through inhibition of autophagy enhances pancreatic cancer cells in Kyrgyzstan Objective to investigate the chemosensitivity to gemcitabine chrysin combined with gemcitabine on pancreatic cancer cell proliferation, apoptosis and its mechanism. The cell proliferation activity was detected by CCK-8 method; cell apoptosis by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry; inverted microscope observation of the drug alone or in combination with effects on cell morphology; expression of autophagy and apoptosis detection by Western blotting; using RNAi technique to silence autophagy key genes Beclin1, ATG5, detected the proliferation of gemcitabine on pancreatic cancer ATG7 cells, changes of apoptosis. Results of gemcitabine by time and concentration dependent manner inhibited the proliferation of pancreatic cancer cells; Western blotting showed that increased expression of gemcitabine induced pancreatic cancer cell LC3- II, p62 and autophagy substrate protein expression decreased; gemcitabine and lysosomal inhibitor CQ with LC3- II. The expression of CQ was significantly increased compared with single; whether autophagy with CQ or silent key autophagy genes Beclin1, ATG5, ATG7, significantly increased the antitumor effect of gemcitabine in pancreatic cancer cells; when combined with gemcitabine and chrysin after use, the expression of LC3- II is the two single by increased significantly; at the same time, with the combination of the two drugs with a single drug use can inhibit the activity of pancreatic cancer cells and induce cell apoptosis, and in combination on the basis of after joining the CQ did not increase the cell killing effect; Western blotting showed that the two drugs combined with a single drug can increase PARP, Caspase-9, activation of Caspase-3 shear body, and further increase the ratio of Bax/Bcl-2. Conclusion gemcitabine partially inhibited and apoptosis induced by protective autophagy in pancreatic cancer cell proliferation: inhibition of autophagy by chrysin enhances chemosensitivity to gemcitabine in pancreatic cancer cells.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9

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本文編號：1580710