發(fā)布時(shí)間：2018-03-07 00:37

  本文選題：Cdc42　切入點(diǎn)：67LR　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:膽管細(xì)胞癌是相對(duì)比較常見的消化道系統(tǒng)惡性腫瘤之一,隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展,近年來該腫瘤診斷、發(fā)現(xiàn)率不斷提高,特別是肝外膽管細(xì)胞癌提高最為明顯。作為消化道的實(shí)體性惡性腫瘤,其典型的生物學(xué)表現(xiàn)主要是原位膨脹及浸潤(rùn)生長(zhǎng),侵襲轉(zhuǎn)移是其主要的致死原因,外科干預(yù)性治療是目前主要的治療方式,但不能保證膽管癌的遠(yuǎn)處、淋巴結(jié)及微小轉(zhuǎn)移灶的徹底根除,術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移難以避免,此情況嚴(yán)重制約了膽管癌的手術(shù)切除效果及預(yù)后評(píng)估,通過對(duì)膽管細(xì)胞癌的深入認(rèn)識(shí),可以針對(duì)膽管癌患者提出一個(gè)綜合性的治療方案,并根據(jù)患者的具體病理特點(diǎn)來判斷預(yù)后,而這些都需要技術(shù)和理論的支持。前期的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),67 LR蛋白過表達(dá)的膽管癌細(xì)胞株(QBC939、RBE)其突觸形成明顯多于正常的膽管上皮細(xì)胞,且在mRNA水平其表達(dá)水平亦明顯增高。67 LR是一種非整合素受體,多表達(dá)于消化道上皮細(xì)胞表面,一些研究表明其參與細(xì)胞與基底膜以及細(xì)胞外基質(zhì)的粘附功能。另外研究表明多種組織的惡性腫瘤中67LR表達(dá)增高,并通過多種機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞癌中67LR過表達(dá),顯著促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲。我們猜想在67LR高表達(dá)細(xì)胞株中出現(xiàn)的突觸形成增多,是否為67LR過表達(dá)促進(jìn)了突觸形成或啟動(dòng),直接或間接的激活了突觸形成的信號(hào)分子。在腫瘤細(xì)胞中,突觸形成是與Rho GTP酶密切相關(guān)的。RHO GTP酶是一類Ras相關(guān)的信號(hào)分子,在腫瘤中可出現(xiàn)異常的激活或抑制。Rho GTP酶可以將GDP偶聯(lián)去活化為GTP形式,活性形式可以結(jié)合一定數(shù)量的效應(yīng)分子,信號(hào)級(jí)聯(lián)放大,從而調(diào)控各種細(xì)胞過程。Rho其家族成員主要包括有Rho A、Rho B、RhoC、Rac1、Rac2、Rac4、Cdc42等多個(gè)分子,該族成員分子為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)中間參與分子,例如Rho A誘導(dǎo)張力纖維的形成,Racl誘導(dǎo)細(xì)胞板狀偽足和細(xì)胞膜皺壁的形成,Cdc42是Rho家族蛋白(Rho GTPase)中的重要成員之一,主要參與細(xì)胞侵襲足的形成等,并可通過參與激活下游的信號(hào)分子及效應(yīng)分子產(chǎn)生一系列的生物學(xué)反應(yīng),從而調(diào)控細(xì)胞的骨架重構(gòu)及細(xì)胞極性的變化。近年研究發(fā)現(xiàn),Rho家族分子與不同的組織來源所起到的作用不同,在某些惡性腫瘤的(乳腺癌、頭頸部腫瘤等)出現(xiàn)cdc42的高表達(dá)情況,而在某些肝臟病變及血液系統(tǒng)腫瘤中出現(xiàn)cdc42低表達(dá)的表型。我們將針對(duì)67lr過表達(dá)的出現(xiàn)的體外細(xì)胞株突觸(侵襲足)增多情況,研究cdc42在膽管細(xì)胞癌中表達(dá)模式情況如何。67lr過表達(dá)是否通過影響cdc42,進(jìn)而促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。目的:應(yīng)用免疫組織化學(xué)(immuno-histochemistry,ihc)、real-timepcr、免疫熒光、westernblot方法從組織蛋白和mrna水平檢測(cè)cdc42蛋白的表達(dá)水平,探討在臨床上明確診斷的膽管細(xì)胞癌中cdc42的表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性以及cdc42在膽管癌患者預(yù)后評(píng)估中的作用和意義。并研究67lr過表達(dá)調(diào)控cdc42影響膽管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。材料方法:1.根據(jù)免疫組化染色的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目以及染色強(qiáng)度對(duì)cdc42的表達(dá)量進(jìn)行半定量分析,采用免疫組化染色的方法對(duì)87例膽管癌標(biāo)本、23例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和18例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本(2005-2010行膽管癌手術(shù)治療患者標(biāo)本),并對(duì)比淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中cdc42的表達(dá)差異。2.cdc42蛋白表達(dá)量與膽管癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析,cdc42表達(dá)量與膽管癌患者生存率的相關(guān)性采用kaplan-meier法分析并用log-rank檢測(cè);采用cox多元線性回歸分析所有涉及的臨床病理指標(biāo),評(píng)估其對(duì)膽管癌患者總生存時(shí)間和無瘤生存時(shí)間的影響。3.構(gòu)建cdc42干擾和過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞株(qbc939和rbe),干預(yù)cdc42表達(dá);通過劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn),研究cdc42對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。4.采用免疫組化觀察87例膽管癌組織中67lr的表達(dá)情況,分析67lr和cdc42表達(dá)的相關(guān)性。構(gòu)建67lr干擾和過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞(qbc939和rbe);通過real-timepcr、western-blot實(shí)驗(yàn),研究膽管癌細(xì)胞中干預(yù)67lr表達(dá)對(duì)cdc42表達(dá)的影響;采用染色質(zhì)免疫共沉淀(chip)實(shí)驗(yàn),研究膽管癌細(xì)胞中cdc42能否與67lr基因啟動(dòng)子結(jié)合。通過western-blot實(shí)驗(yàn),研究膽管癌細(xì)胞中干預(yù)67lr表達(dá)對(duì)活性cdc42表達(dá)的影響。研究結(jié)果1.明確診斷的膽管癌切除組織標(biāo)本中(87例),34例癌組織(39%)呈現(xiàn)cdc42胞漿染色陽(yáng)性;而24例癌旁組織cdc42有4例呈陽(yáng)性(17%),而其余染色陰性;提示膽管癌中存在cdc42異常高表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。分析cdc42表達(dá)與患者臨床病理特性相關(guān)性提示:cdc42陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),而與患者性別、年齡、原發(fā)灶tnm分級(jí)、組織分化程度無關(guān)。32例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中,25例(78%)出現(xiàn)cdc42染色陽(yáng)性,陽(yáng)性率顯著高于原發(fā)灶(39%);18例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶中,13例(75%)呈cdc42染色陽(yáng)性,其陽(yáng)性率也高于原發(fā)灶;這些結(jié)果提示:膽管癌中cdc42異常表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。2.kaplan-meier分析結(jié)果顯示:cdc42陽(yáng)性表達(dá)的患者術(shù)后總存活時(shí)間顯著低于cdc42陰性組患者(log-rankp=0.002);而其腫瘤復(fù)發(fā)顯著早于cdc42陰性表達(dá)的患者(log-rankp=0.002)。cox模型分析提示:cdc42異常表達(dá)是判斷病人術(shù)后存活時(shí)間和腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間的相對(duì)獨(dú)立危險(xiǎn)因素(hr=2.047,95%ci=1.414-3.581,p=0.002;hr=1.892,95%ci=1.315-3.203,p=0.003)。本部分結(jié)果提示:cdc42異常表達(dá)可能是判斷膽管患者預(yù)后的潛在分子標(biāo)志。3.利用體外膽管癌細(xì)胞株(qbc939、rbe)免疫熒光檢測(cè),觀察cdc42在兩株細(xì)胞間的差異,并通過劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn),得出qbc939細(xì)胞株中干擾cdc42表達(dá)顯著抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力;而rbe細(xì)胞株中過表達(dá)cdc42明顯增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。本部分實(shí)驗(yàn)提示:cdc42過表達(dá)可能促進(jìn)膽管癌細(xì)侵襲轉(zhuǎn)移。4.明確診斷的膽管癌切除組織標(biāo)本中(87例),35例(40%)呈現(xiàn)67lr膜染色陽(yáng)性�？ǚ綑z驗(yàn)提示67lr表達(dá)與cdc42表達(dá)情況顯著相關(guān)。連續(xù)切片免疫組化發(fā)現(xiàn):67lr和cdc42在膽管癌組織的表達(dá)具有相對(duì)的一致性。5.在體外膽管癌細(xì)胞株(qbc939)中干擾67lr的表達(dá),cdc42的mrna和蛋白表達(dá)無明顯變化。在膽管癌細(xì)胞株(rbe)中上調(diào)67lr的表達(dá),cdc42的mrna和蛋白表達(dá)無明顯變化。chip實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示qbc939和rbe細(xì)胞中cdc42與67lr基因啟動(dòng)子區(qū)無結(jié)合。通過westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)qbc939中干擾67lr的表達(dá),活性cdc42的表達(dá)降低,rbe中上調(diào)67lr表達(dá),活性cdc42的表達(dá)增強(qiáng)。本部分結(jié)果提示膽管癌細(xì)胞株體外體外實(shí)驗(yàn)中,67lr可能通過增強(qiáng)cdc42的活性形式的促進(jìn)膽管癌的侵襲作用。結(jié)論:1.利用ihc、westernblot、以及pcr等分子生物學(xué)研究手段發(fā)現(xiàn)cdc42在膽管細(xì)胞癌中存在異常高表達(dá);2.cdc42表達(dá)量與腫瘤的淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的相關(guān)性;并與膽管癌的預(yù)后密切相關(guān)。3.67LR可能通過調(diào)節(jié)Cdc42的活性形式促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Tosikazu AMANO,Olivia KWAK,Anastasia MARSHAK;The matrix metalloproteinase stromelysin-3 cleaves laminin receptor at two distinct sites between the transmembrane domain and laminin binding sequence within the extracellular domain[J];Cell Research;2005年03期

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本文編號(hào)：1577227