本文選題：Cdc42　切入點：67LR　出處：《第三軍醫(yī)大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:膽管細胞癌是相對比較常見的消化道系統惡性腫瘤之一,隨著醫(yī)學科學的發(fā)展,近年來該腫瘤診斷、發(fā)現率不斷提高,特別是肝外膽管細胞癌提高最為明顯。作為消化道的實體性惡性腫瘤,其典型的生物學表現主要是原位膨脹及浸潤生長,侵襲轉移是其主要的致死原因,外科干預性治療是目前主要的治療方式,但不能保證膽管癌的遠處、淋巴結及微小轉移灶的徹底根除,術后出現復發(fā)、轉移難以避免,此情況嚴重制約了膽管癌的手術切除效果及預后評估,通過對膽管細胞癌的深入認識,可以針對膽管癌患者提出一個綜合性的治療方案,并根據患者的具體病理特點來判斷預后,而這些都需要技術和理論的支持。前期的實驗研究發(fā)現,67 LR蛋白過表達的膽管癌細胞株(QBC939、RBE)其突觸形成明顯多于正常的膽管上皮細胞,且在mRNA水平其表達水平亦明顯增高。67 LR是一種非整合素受體,多表達于消化道上皮細胞表面,一些研究表明其參與細胞與基底膜以及細胞外基質的粘附功能。另外研究表明多種組織的惡性腫瘤中67LR表達增高,并通過多種機制促進癌細胞侵襲轉移。本實驗室前期實驗已發(fā)現膽管細胞癌中67LR過表達,顯著促進癌細胞侵襲。我們猜想在67LR高表達細胞株中出現的突觸形成增多,是否為67LR過表達促進了突觸形成或啟動,直接或間接的激活了突觸形成的信號分子。在腫瘤細胞中,突觸形成是與Rho GTP酶密切相關的。RHO GTP酶是一類Ras相關的信號分子,在腫瘤中可出現異常的激活或抑制。Rho GTP酶可以將GDP偶聯去活化為GTP形式,活性形式可以結合一定數量的效應分子,信號級聯放大,從而調控各種細胞過程。Rho其家族成員主要包括有Rho A、Rho B、RhoC、Rac1、Rac2、Rac4、Cdc42等多個分子,該族成員分子為細胞內重要的信號中間參與分子,例如Rho A誘導張力纖維的形成,Racl誘導細胞板狀偽足和細胞膜皺壁的形成,Cdc42是Rho家族蛋白(Rho GTPase)中的重要成員之一,主要參與細胞侵襲足的形成等,并可通過參與激活下游的信號分子及效應分子產生一系列的生物學反應,從而調控細胞的骨架重構及細胞極性的變化。近年研究發(fā)現,Rho家族分子與不同的組織來源所起到的作用不同,在某些惡性腫瘤的(乳腺癌、頭頸部腫瘤等)出現cdc42的高表達情況,而在某些肝臟病變及血液系統腫瘤中出現cdc42低表達的表型。我們將針對67lr過表達的出現的體外細胞株突觸(侵襲足)增多情況,研究cdc42在膽管細胞癌中表達模式情況如何。67lr過表達是否通過影響cdc42,進而促進膽管癌細胞侵襲轉移。目的:應用免疫組織化學(immuno-histochemistry,ihc)、real-timepcr、免疫熒光、westernblot方法從組織蛋白和mrna水平檢測cdc42蛋白的表達水平,探討在臨床上明確診斷的膽管細胞癌中cdc42的表達水平與患者臨床病理參數的相關性以及cdc42在膽管癌患者預后評估中的作用和意義。并研究67lr過表達調控cdc42影響膽管癌細胞的侵襲轉移的可能機制。材料方法:1.根據免疫組化染色的陽性細胞數目以及染色強度對cdc42的表達量進行半定量分析,采用免疫組化染色的方法對87例膽管癌標本、23例淋巴結轉移灶和18例遠處轉移灶標本(2005-2010行膽管癌手術治療患者標本),并對比淋巴結轉移及遠處轉移灶與原發(fā)灶中cdc42的表達差異。2.cdc42蛋白表達量與膽管癌臨床病理參數相關性分析,cdc42表達量與膽管癌患者生存率的相關性采用kaplan-meier法分析并用log-rank檢測;采用cox多元線性回歸分析所有涉及的臨床病理指標,評估其對膽管癌患者總生存時間和無瘤生存時間的影響。3.構建cdc42干擾和過表達載體,轉染膽管癌細胞株(qbc939和rbe),干預cdc42表達;通過劃痕實驗、transwell侵襲實驗,研究cdc42對膽管癌細胞遷移、侵襲和轉移能力的影響。4.采用免疫組化觀察87例膽管癌組織中67lr的表達情況,分析67lr和cdc42表達的相關性。構建67lr干擾和過表達載體,轉染膽管癌細胞(qbc939和rbe);通過real-timepcr、western-blot實驗,研究膽管癌細胞中干預67lr表達對cdc42表達的影響;采用染色質免疫共沉淀(chip)實驗,研究膽管癌細胞中cdc42能否與67lr基因啟動子結合。通過western-blot實驗,研究膽管癌細胞中干預67lr表達對活性cdc42表達的影響。研究結果1.明確診斷的膽管癌切除組織標本中(87例),34例癌組織(39%)呈現cdc42胞漿染色陽性;而24例癌旁組織cdc42有4例呈陽性(17%),而其余染色陰性;提示膽管癌中存在cdc42異常高表達具有統計學意義(p0.01)。分析cdc42表達與患者臨床病理特性相關性提示:cdc42陽性表達與淋巴結轉移、遠處轉移顯著相關,而與患者性別、年齡、原發(fā)灶tnm分級、組織分化程度無關。32例淋巴結轉移灶中,25例(78%)出現cdc42染色陽性,陽性率顯著高于原發(fā)灶(39%);18例遠處轉移灶中,13例(75%)呈cdc42染色陽性,其陽性率也高于原發(fā)灶;這些結果提示:膽管癌中cdc42異常表達與腫瘤侵襲轉移相關。2.kaplan-meier分析結果顯示:cdc42陽性表達的患者術后總存活時間顯著低于cdc42陰性組患者(log-rankp=0.002);而其腫瘤復發(fā)顯著早于cdc42陰性表達的患者(log-rankp=0.002)。cox模型分析提示:cdc42異常表達是判斷病人術后存活時間和腫瘤復發(fā)時間的相對獨立危險因素(hr=2.047,95%ci=1.414-3.581,p=0.002;hr=1.892,95%ci=1.315-3.203,p=0.003)。本部分結果提示:cdc42異常表達可能是判斷膽管患者預后的潛在分子標志。3.利用體外膽管癌細胞株(qbc939、rbe)免疫熒光檢測,觀察cdc42在兩株細胞間的差異,并通過劃痕實驗、transwell侵襲實驗,得出qbc939細胞株中干擾cdc42表達顯著抑制癌細胞的侵襲和遷移能力;而rbe細胞株中過表達cdc42明顯增強癌細胞的侵襲和遷移能力。本部分實驗提示:cdc42過表達可能促進膽管癌細侵襲轉移。4.明確診斷的膽管癌切除組織標本中(87例),35例(40%)呈現67lr膜染色陽性�？ǚ綑z驗提示67lr表達與cdc42表達情況顯著相關。連續(xù)切片免疫組化發(fā)現:67lr和cdc42在膽管癌組織的表達具有相對的一致性。5.在體外膽管癌細胞株(qbc939)中干擾67lr的表達,cdc42的mrna和蛋白表達無明顯變化。在膽管癌細胞株(rbe)中上調67lr的表達,cdc42的mrna和蛋白表達無明顯變化。chip實驗結果提示qbc939和rbe細胞中cdc42與67lr基因啟動子區(qū)無結合。通過westernblot檢測發(fā)現qbc939中干擾67lr的表達,活性cdc42的表達降低,rbe中上調67lr表達,活性cdc42的表達增強。本部分結果提示膽管癌細胞株體外體外實驗中,67lr可能通過增強cdc42的活性形式的促進膽管癌的侵襲作用。結論:1.利用ihc、westernblot、以及pcr等分子生物學研究手段發(fā)現cdc42在膽管細胞癌中存在異常高表達;2.cdc42表達量與腫瘤的淋巴結及遠處轉移具有統計學意義上的相關性;并與膽管癌的預后密切相關。3.67LR可能通過調節(jié)Cdc42的活性形式促進膽管癌細胞侵襲轉移。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.8

【參考文獻】

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1 Tosikazu AMANO,Olivia KWAK,Anastasia MARSHAK;The matrix metalloproteinase stromelysin-3 cleaves laminin receptor at two distinct sites between the transmembrane domain and laminin binding sequence within the extracellular domain[J];Cell Research;2005年03期

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本文編號：1577227