本文選題：A549　切入點：細(xì)胞　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景由于癌癥發(fā)病率和死亡率的持續(xù)增高,目前仍然是世界上重要的公共衛(wèi)生問題。從2010年開始,癌癥在中國已成為主要的致死原因。根據(jù)中國癌癥中心2016年報道,在分析了國內(nèi)2009-2011年72個始終可用的登記中心數(shù)據(jù)后,對2015年新發(fā)病例及死亡數(shù)進(jìn)行估計,預(yù)計有4292000個新發(fā)癌癥病例和2814000個癌癥死亡病例,其中肺癌的發(fā)病率和死亡率最高,總發(fā)病率為733300人,其中男性為509300人,占惡性腫瘤第一位,女性為224000人,僅次于乳腺癌發(fā)病率;總死亡率為610200人,其中男性為432400人,女性為177800人,死亡率均為第一位。近年來,肺癌發(fā)病率最高的病理類型已由肺鱗癌向肺腺癌轉(zhuǎn)變,肺腺癌成為肺癌中發(fā)病率最高的類型,約占非小細(xì)胞肺癌的一半,而非小細(xì)胞肺癌約占全部肺癌的85%。肺腺癌易復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后相對鱗癌差。目前,肺腺癌的治療方案是以外科手術(shù)為主的綜合治療,化療為其中的綜合治療方法之一。肺癌的化療以聯(lián)合用藥為主,鉑類為聯(lián)合用藥的基礎(chǔ)藥物之一。順鉑(cisplatin,DDP)是最常用于肺癌化療的一線鉑類藥物,在肺癌的綜合治療中具有重要作用。雖然肺腺癌對化療比較敏感,但由于各種原因?qū)е虏糠只颊弋a(chǎn)生耐藥,從而降低了化療效果,致使病情進(jìn)展,出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。DDP為鉑的金屬絡(luò)合物,其靶點為DNA,作用在鏈間與鏈內(nèi)交鏈,形成DDP-DNA復(fù)合物,從而干擾DNA的復(fù)制,屬周期非特異性細(xì)胞毒藥物。目前鉑類藥物主要耐藥機(jī)制包括:增強(qiáng)了藥物的失活、減少了細(xì)胞內(nèi)藥物積累、增強(qiáng)DNA修復(fù)能力、間接調(diào)控因子變化等,涉及多種基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。然而肺腺癌的耐順鉑機(jī)制復(fù)雜,目前尚未完全闡明。因此進(jìn)一步研究順鉑的肺腺癌耐藥機(jī)制,改善化療的敏感性,提高化療效果,對延長耐藥患者的生存時間具有重要意義。半乳糖凝集素-1(Galectin-1,Gal-1)是β半乳糖凝集素家族成員之一,在多種組織中分布,與較多生理過程有關(guān)。Gal-1由位于22q12染色體的LGALS1基因編碼,其中對Gal-1表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制中包括啟動子的甲基化狀態(tài)。Gal-1過表達(dá)與細(xì)胞轉(zhuǎn)化、粘附、增殖、血管生成以及侵襲等方面有關(guān),對腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后具有較大影響。Gal-1的高表達(dá)與多種惡性腫瘤有關(guān),例如鼻咽癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和胃癌等。有研究顯示,Gal-1的表達(dá)與宮頸癌的分期、浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。目前國內(nèi)外在腫瘤耐藥方面篩選基因或蛋白時發(fā)現(xiàn)Gal-1可能與部分腫瘤耐順鉑有關(guān)。由此說明,Gal-1參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展,深入研究Gal-1在惡性腫瘤中的作用對于臨床上診治惡性腫瘤具有重要意義。目前國內(nèi)外尚未見對耐順鉑肺腺癌中Gal-1進(jìn)行體內(nèi)外研究的報道,本課題重點研究探索Gal-1在肺腺癌耐順鉑中的潛在機(jī)制。RNA干擾(RNAinterference,RNAi),由Fire等在1998年首次發(fā)現(xiàn)并給予命名,作為在2002年度美國科學(xué)界最重要的科技成果之一。在隨后的幾年中,在RNAi方面的研究發(fā)展迅速,取得了很多重要研究成果:2001年在哺乳動物的細(xì)胞培養(yǎng)中,應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行抑制基因的表達(dá)被首次報道,創(chuàng)新性的應(yīng)用該技術(shù)在高等生物基因功能中進(jìn)行研究;2002年RNAi技術(shù)用于哺乳動物的實驗研究;2004年RNAi技術(shù)用酶法構(gòu)建全基因組短干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)文庫新技術(shù),并對動物基因功能進(jìn)行了高通量RNAi研究等。腫瘤多藥耐藥的發(fā)生是多基因、多因素參與的過程,而RNAi成為了研究腫瘤多藥耐藥的新策略。本課題設(shè)計采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默Gal-1,觀察Gal-1被干擾后對順鉑的敏感性實驗,研究Gal-1對耐順鉑A549(A549/DDP)細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。用A549細(xì)胞系、A549/DDP細(xì)胞系及沉默Gal-1的細(xì)胞系接種裸鼠成瘤,進(jìn)行順鉑的敏感性實驗;通過體內(nèi)、外實驗驗證Gal-1對A549/DDP細(xì)胞系耐藥的影響。同時選擇臨床中肺腺癌手術(shù)患者,對其組織進(jìn)行Gal-1的檢測,并收集臨床相關(guān)數(shù)據(jù),進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。通過體內(nèi)、外實驗及臨床相關(guān)性研究,進(jìn)一步了解Gal-1在肺腺癌順鉑耐藥中的機(jī)制,為針對逆轉(zhuǎn)肺腺癌順鉑耐藥進(jìn)行研發(fā)藥物提供實驗依據(jù)。第一部分Galectin-1在人肺腺癌A549及A549/DDP細(xì)胞中表達(dá)情況目的通過檢測Gal-1在人肺腺癌A549及A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá)情況,探討Gal-1對人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞系耐順鉑的影響。方法1.人肺腺癌A549及A549/DDP細(xì)胞常規(guī)進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存;2.將兩組細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng),按梯度加入順鉑,共分為10個濃度梯度,分別為(0,0.1,0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4,12.8,25.6)μg/ml,每個梯度設(shè)為5個復(fù)孔,應(yīng)用CCK8法測定兩組細(xì)胞OD值,然后通過半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)及耐藥指數(shù)驗證 A549/DDP細(xì)胞的耐藥性;3.應(yīng)用RT-PCR和Western blot兩種方法分別檢測兩組細(xì)胞中Gal-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果1.A549 細(xì)胞的 IC50 值為:2.16±0.30μg/ml;A549/DDP 細(xì)胞的 IC50 值為:17.66±1.21μg/ml,耐藥指數(shù)為 8.18(P0.05)。2.與A549細(xì)胞相比較,Gal-1 mRNA的表達(dá)水平在A549/DDP細(xì)胞中顯著升高(0.76±0.03vs.0.39±0.01;P0.05)。3.與A549細(xì)胞相比較,Gal-1蛋白表達(dá)水平在A549/DDP細(xì)胞中顯著升高(0.85 ±0.03 vs.0.61 ±0.02;P0.05)。結(jié)論1.人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞耐藥性穩(wěn)定,耐藥指數(shù)為8.18。2.Gal-1可能是A549/DDP細(xì)胞系耐順鉑的一個潛在基因,可作為候選耐藥蛋白進(jìn)一步研究。第二部分 沉默Galectin-1對A549/DDP細(xì)胞逆轉(zhuǎn)作用的體內(nèi)外實驗研究目的通過沉默Gal-1在人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞中的表達(dá),在體內(nèi)外實驗中逆轉(zhuǎn)A549/DDP細(xì)胞對順鉑的耐藥性,探討Gal-1影響A549/DDP細(xì)胞耐順鉑的作用,為進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制和藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。方法1.應(yīng)用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法沉默人肺腺癌A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞中的Gal-1,將細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)傳代。2.應(yīng)用RT-PCR和Western blot兩種方法分別檢測A549、A549/DDP細(xì)胞和對照組 A549/C、A549/DDP/C 細(xì)胞及沉默 Gal-1 的 A549(A549/I)、A549/DDP(A549/DDP/I)細(xì)胞中Gal-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。3.應(yīng)用CCK8法測定OD值,計算各組細(xì)胞的IC50,計算A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 細(xì)胞的耐藥指數(shù)。4.通過在裸鼠腋下注射 A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I細(xì)胞建立裸鼠腫瘤模型,在成功構(gòu)建成瘤模型的裸鼠中,每組隨機(jī)選取5只裸鼠進(jìn)行實驗。腹腔內(nèi)注射順鉑,觀察腫瘤在模型體內(nèi)的生長,4周后處死裸鼠,測量腫瘤重量及直徑。5.應(yīng)用免疫組織化學(xué)和Western blot兩種方法分別檢測A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 組裸鼠腫瘤中 Gal-1 的表達(dá)。結(jié)果1.Gal-1 mRNA 在 A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I細(xì)胞中表達(dá)量分別為:0.38±0.01、0.39±0.03、0.22±0.02、0.76±0.02、0.75±0.05、0.23±0.03。在A549/DDP細(xì)胞中的Gal-1 mRNA表達(dá)高于在A549中的表達(dá)(P0.05);A549/I、A549/DDP/I細(xì)胞組間Gal-1 mRNA的表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),均低于在A549中的表達(dá)(P0.05)。2.Gal-1 蛋白在 A549、A549/C、A549/1、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I細(xì)胞中表達(dá)量分別為:0.61±0.02、0.59±0.03、0.28±0.02、0.85±0.03、0.84±0.01、0.31±0.04。在A549/DDP細(xì)胞中的Gal-1蛋白表達(dá)高于在A549中的表達(dá)(P0.05);A549/I、A549/DDP/I細(xì)胞組間Gal-1蛋白的表達(dá)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),均低于在A549中的表達(dá)(P0.05)。3.A549 細(xì)胞的 IC50 值為 2.16±0.30μg/ml;A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 細(xì)胞的 IC50 值分別為 2.17±0.31、1.88±0.27、17.66±1.21、17.48±1.02、2.97±0.18μg/ml;A549/C、A549/1、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 細(xì)胞的耐藥指數(shù)為 1.00、0.87、8.18、8.09、1.38;A549/DDP、A549/DDP/C細(xì)胞組IC50值及耐藥指數(shù)大于A549細(xì)胞組(P0.05);A549、A549/C、A549/I、A549/DDP/I 細(xì)胞組間 IC50 值及耐藥指數(shù)比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.裸鼠成瘤實驗過程中無死亡。A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 組腫瘤體積分別為:761.19±52.13、763.16±51.04、725.84±67.46、1554.61±123.35、1523.58±98.66、804.98±61.63mm3;A549、A549/C、A549/I、A549/DDP、A549/DDP/C、A549/DDP/I 組腫瘤重量分別為:0.35±0.02、0.35±0.02、0.34±0.02、0.70±0.02、0.71±0.03、0.37±0.03g;A549/DDP 組瘤重及體積大于 A549、A549/I、A549/DDP/I 組(P0.05);A549 與 A549/I、A549/DDP/I組比較瘤重及體積無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.在裸鼠腫瘤中,免疫組化與Western blot法檢測結(jié)果表明,Gal-1在A549/I、A549/DDP/I 組的表達(dá)明顯低于 A549/DDP 組(P0.05);而在 A549、A549/DDP組中分別與A549/C和A549/DDP/C組相比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法沉默Gal-1能夠在人肺腺癌A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞中穩(wěn)定傳代。2.人肺腺癌A549細(xì)胞及A549/DDP細(xì)胞均能夠成功構(gòu)建裸鼠成瘤模型。3.沉默Gal-1能夠提高A549/DDP細(xì)胞在體內(nèi)外實驗中對順鉑的敏感性。4.體內(nèi)外實驗進(jìn)一步驗證了 Gal-1在A549/DDP細(xì)胞耐順鉑中產(chǎn)生影響,為進(jìn)一步研究其耐藥機(jī)制和藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。第三部分Galectin-1、ERCC1在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義目的研究人肺腺癌組織中Gal-1、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complementary gene 1,ERCC1)在肺腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法1.收集2011年11月到2012年12月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院胸外科經(jīng)術(shù)后病理證實的肺腺癌手術(shù)患者91例。所有患者均為術(shù)后應(yīng)用含順鉑為基礎(chǔ)的輔助化療方案。采用免疫組化法測定術(shù)后石蠟包埋的肺腺癌組織中Gal-1、ERCC1的表達(dá)情況。2.分析Gal-1與ERCC1的相關(guān)性;Gal-1、ERCC1與患者的年齡、性別、吸煙及臨床分期的相關(guān)性;3.通過對患者的隨訪,將兩種指標(biāo)對預(yù)后的影響進(jìn)行分析,探討與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果1.Gal-1在肺腺癌中的陽性表達(dá)率為30.77%(28/91);ERCC1在肺腺癌中的陽性表達(dá)率為31.87%(29/91)。Gal-1、ERCC1在肺腺癌中同時陽性表達(dá)18例,同時陰性表達(dá)52例。McNemar配對資料χ2檢驗的結(jié)果,P=1.00(P0.05),提示Gal-1、ERCC1在肺腺癌中的表達(dá)無顯著性差異。而根據(jù)臨床診斷一致性 Kappa 檢驗,Kappa=0.46,P=0.00(P0.05),說明 Gal-1、ERCC1 在肺腺癌中的表達(dá)具有一致性。2.肺腺癌組織中Gal-1的表達(dá)與患者的性別、年齡、是否吸煙、TNM分期等臨床指標(biāo)無相關(guān)性(P0.05)。3.肺腺癌組織中ERCC1的表達(dá)與患者的性別、年齡、是否吸煙、TNM分期等臨床指標(biāo)無相關(guān)性(P0.05)。4.Gal-1 陽性表達(dá)組中位無瘤生存期(disease-free survival,DFS)為(19±1.96)個月,而陰性表達(dá)組為(27±1.62)個月,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.48,P=0.00)。Gal-1 陽性表達(dá)組中位總生存時間(overall survival,OS)為(22±1.02)個月,而陰性表達(dá)組為(33±1.56)個月,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.81,P=0.00)。5.ERCC1陽性表達(dá)組中位DFS為(21±1.30)個月,而陰性表達(dá)組為(27±1.53)個月,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.03,P=0.01)。ERCC1陽性表達(dá)組中位OS為(25±1.04)個月,而陰性表達(dá)組為(33±1.72)個月,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.64,P=0.00)。6.Gal-1、ERCC1同時陽性表達(dá)組中位DFS為(18±2.83)個月,而陰性表達(dá)組為(29±1.40)個月,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.13,P=0.00)。Gal-1、ERCC1同時陽性表達(dá)組中位OS為(22±1.00)個月,而陰性表達(dá)組為(35±1.77)個月,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=21.30,P=0.00)。結(jié)論1.Gal-1與ERCC1在肺腺癌中的表達(dá)具有一致性。2.Gal-1、ERCC1與肺腺癌患者的性別、年齡、吸煙、TNM分期等臨床指標(biāo)無相關(guān)性。3.Gal-1、ERCC1與肺腺癌的術(shù)后輔助化療的預(yù)后有關(guān),可作為判斷預(yù)后的指標(biāo),同時檢測具有更好的準(zhǔn)確性。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1576544