本文選題：基質(zhì)細(xì)胞源性趨化因子　切入點(diǎn)：背根神經(jīng)節(jié)　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究一 大鼠骨癌痛模型的建立及酸感受離子通道(ASIC)亞基的表達(dá)目的通過(guò)建立大鼠骨癌痛模型并研究其背根神經(jīng)節(jié)(DRG)上ASIC亞基mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化,來(lái)探索ASIC亞基在骨癌痛發(fā)生發(fā)展中的作用。方法Sprague-Dawley大鼠45只隨機(jī)分為三組：假手術(shù)組(sham, n=15),骨癌痛模型7天組(C7,n=15),骨癌痛模型14天組(C14,n=15)。三組大鼠分別于左后肢脛骨上段髓腔內(nèi)注射5μL生理鹽水(sham組)或1×104/μL walker256鼠源性乳腺癌細(xì)胞生理鹽水懸浮液(C7組和C14組),建立癌痛模型。術(shù)后密切觀察大鼠健康狀況，，用Von Frey filament(VFF)細(xì)絲和CO2激光熱刺激儀測(cè)量大鼠左下肢機(jī)械痛敏縮足閾值(Paw withdrawal threshold,PWT)和熱痛敏PWT的變化。分別于術(shù)后7天和14天對(duì)大鼠進(jìn)行行microCT影像學(xué)檢查和HE病理學(xué)檢查,以確定腫瘤對(duì)脛骨的破壞情況。在各組觀察期結(jié)束時(shí),分別取腰4、腰5(L4、L5)DRG。RT-PCR,免疫印跡和免疫熒光分別用來(lái)檢測(cè)DRG上ASIC的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。結(jié)果與sham組大鼠相比,C7、C14術(shù)側(cè)下肢機(jī)械痛敏PWT和熱痛敏PWT明顯下降(P0.01)。Micro CT圖像表明,C7組脛骨破壞不明顯,C14組有明顯的骨質(zhì)破壞,甚至有骨皮質(zhì)的缺損。與假手術(shù)組相比較,在六個(gè)ASIC亞基中,只有C14組同側(cè)的ASIC3亞基的：mRNA表達(dá)升高(P0.05)。但是在蛋白表達(dá)方面,除了ASIC2a,同側(cè)的ASIC1, ASIC3, ASIC4亞基蛋白都不同程度的表達(dá)升高(P0.01)。免疫雙標(biāo)的方法檢測(cè)到與假手術(shù)組相比較,C14組手術(shù)中ASIC3和異凝集素-B4(IB4)共表達(dá)的神經(jīng)元的數(shù)目更多。另外,我們也發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比較,C14組中ASIC3和neurofilament 200 (NF200)共同表達(dá)的DRG神經(jīng)元更多。結(jié)論大鼠脛骨內(nèi)注射Walker256細(xì)胞可以成功復(fù)制骨癌痛模型。大鼠脊髓左側(cè)L4、L5 DRG上ASIC3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯增高,提示ASIC3亞基可能在骨癌痛的發(fā)生發(fā)展中有一定作用。組同側(cè)的ASIC3亞基的：mRNA表達(dá)升高(P0.05)。但是在蛋白表達(dá)方面,除了ASIC2a,同側(cè)的ASIC1, ASIC3, ASIC4亞基蛋白都不同程度的表達(dá)升高(P0.01)。免疫雙標(biāo)的方法檢測(cè)到與假手術(shù)組相比較,C14組手術(shù)中ASIC3和異凝集素-B4(IB4)共表達(dá)的神經(jīng)元的數(shù)目更多。另外,我們也發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比較,C14組中ASIC3和neurofilament 200 (NF200)共同表達(dá)的DRG神經(jīng)元更多。結(jié)論大鼠脛骨內(nèi)注射Walker256細(xì)胞可以成功復(fù)制骨癌痛模型。大鼠脊髓左側(cè)L4、L5 DRG上ASIC3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯增高,提示ASIC3亞基可能在骨癌痛的發(fā)生發(fā)展中有一定作用。研究二SDF-1及其下游信號(hào)通路對(duì)于Nav1.8電流的調(diào)節(jié)作用目的趨化因子作為一種新的神經(jīng)調(diào)質(zhì)參與脊髓水平和脊髓上水平的疼痛感知過(guò)程。Stromal cell-derived factor 1 (SDF-1),又名chemokine CXC motif ligand 12(CXCL12),在慢性疼痛模型動(dòng)物的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)上的表達(dá)升高。但是SDF-1對(duì)于河豚毒素不敏感(TTXR)內(nèi)通道Nav1.8電流變化的作用機(jī)制尚未得到研究。本文就是利用電生理學(xué)的方法研究SDF-1及其受體CXCR4對(duì)于Navl.8鈉離子通道的調(diào)控作用。方法免疫熒光的方法用來(lái)檢測(cè)Nav1.8和CXCR4在DRG神經(jīng)元上的共分布。急性分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元和不同濃度的SDF-1 (5,25,50,200,400 ng/mL)進(jìn)行孵育1-2小時(shí)。全細(xì)胞電壓鉗記錄空白對(duì)照組和不同濃度SDF-1孵育組DRG神經(jīng)元上的Nav1.8電流的變化,以觀察SDF-1對(duì)Navl.8電流的影響。隨后,全細(xì)胞電壓鉗技術(shù)記錄CXCR4受體抑制劑AMD3100、G蛋白抑制劑百日咳毒素(PTX)和霍亂毒素(CTX)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002對(duì)于Nav1.8電流的影響。結(jié)果利用免疫熒光的方法,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)42%的DRG神經(jīng)元是CXCR4蛋白和Nav1.8鈉離子通道蛋白共同表達(dá)的。SDF-1預(yù)處理急性分離的小直徑的DRG神經(jīng)元,會(huì)記錄到神經(jīng)元上Nav1.8電流幅度呈現(xiàn)SDF-1濃度依賴(lài)性的增高。SDF-1也使得Nav1.8電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化的方向發(fā)展。實(shí)驗(yàn)中所用的抑制劑(AMD3100,PTX, CTX, LY294002)都會(huì)不同程度的增加Nav1.8電流。另外用這些抑制劑預(yù)處理背根神經(jīng)節(jié)也會(huì)使Nav1.8的穩(wěn)態(tài)激活曲線向著超極化的方向轉(zhuǎn)移。結(jié)論SDF-1可以增加Nav1.8電流來(lái)興奮初級(jí)傷害性感受神經(jīng)元,但是SDF-1對(duì)Nav1.8的調(diào)節(jié)可能并不是通過(guò)CXCR4及其下游的G蛋白和PI3K信號(hào)通路。離子通道蛋白共同表達(dá)的。SDF-1預(yù)處理急性分離的小直徑的DRG神經(jīng)元,會(huì)記錄到神經(jīng)元上Nav1.8電流幅度呈現(xiàn)SDF-1濃度依賴(lài)性的增高。SDF-1也使得Nav1.8電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化的方向發(fā)展。實(shí)驗(yàn)中所用的抑制劑(AMD3100,PTX, CTX, LY294002)都會(huì)不同程度的增加Nav1.8電流。另外用這些抑制劑預(yù)處理背根神經(jīng)節(jié)也會(huì)使Nav1.8的穩(wěn)態(tài)激活曲線向著超極化的方向轉(zhuǎn)移。結(jié)論SDF-1可以增加Nav1.8電流來(lái)興奮初級(jí)傷害性感受神經(jīng)元,但是SDF-1對(duì)Nav1.8的調(diào)節(jié)可能并不是通過(guò)CXCR4及其下游的G蛋白和PI3K信號(hào)通路。研究三SDF-1及其下游信號(hào)通路對(duì)于Nav1.9電流的調(diào)節(jié)作用目的研究表明趨化因子是小分子蛋白的細(xì)胞因子超家族,它們?cè)诿庖吆蜕窠?jīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。Stromal cell-derived factor 1(SDF-1),又名chemokine CXC motif ligand 12(CXCL12),在慢性疼痛模型動(dòng)物的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)上的表達(dá)升高。但是SDF-1引起TTXR鈉離子電流Nav1.9電流發(fā)生變化的機(jī)制尚未得到研究。本實(shí)驗(yàn)利用電生理學(xué)的方法研究SDF-1及其受體CXCR4對(duì)于Nav1.9鈉離子通道的調(diào)控作用。方法免疫熒光的方法用來(lái)檢測(cè)Nav1.9和CXCR4在DRG神經(jīng)元上的共表達(dá)。急性分離的DRG神經(jīng)元和不同濃度的SDF-1(5,25,50,200,400 ng/mL)進(jìn)行孵育1-2小時(shí)。全細(xì)胞電壓鉗記錄空白對(duì)照組和SDF-1孵育組DRG神經(jīng)元上的Nav1.9電流的變化,以觀察SDF-1對(duì)Nav1.9電流的影響。同時(shí),全細(xì)胞電壓鉗技術(shù)也記錄了CXCR4受體抑制劑AMD3100、G蛋白抑制劑百日咳毒素(PTX)和霍亂毒素(CTX)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002對(duì)于Navl.9電流的影響。結(jié)果利用免疫熒光的方法,實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)37%的DRG神經(jīng)元是CXCR4蛋白和Nav1.9鈉離子通道蛋白共同表達(dá)的。研究中我們也發(fā)現(xiàn),SDF-1預(yù)處理急性分離的小直徑DRG神經(jīng)元,可以記錄到神經(jīng)元上Nav1.9電流幅度呈現(xiàn)SDF-1濃度依賴(lài)性的增高。SDF-1也使得Nav1.9電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化的方向發(fā)展。對(duì)于Nav1.9通道來(lái)說(shuō),CXCR4受體抑制劑AMD3100可以阻斷SDF-1引起的Nav1.9電流密度和通道動(dòng)力學(xué)特性的改變。PTX而不是CTX可以阻斷SDF-1引起的Navl.9電流的增加,這表明Gi/o蛋白亞基參與SDF-1對(duì)于Nav1.9鈉通道電流的調(diào)節(jié)。另外,磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002也參與SDF-1對(duì)于Nav1.9電流的調(diào)節(jié)。結(jié)論研究表明,SDF-1可能通過(guò)作用于Nav1.9電流來(lái)興奮初級(jí)傷害性感受神經(jīng)元。SDF-1通過(guò)激活其受體CXCR4及其下游信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)Nav1.9電流的變化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R738;R-332

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本文編號(hào)：1574610