本文選題：miR-184　切入點：骨肉瘤　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：骨肉瘤(Osteosarcoma)是骨組織臨床上最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。它好發(fā)于青春期少年及兒童,是青少年及兒童比較常見的惡性腫瘤。它發(fā)生于間葉組織,以成骨特性為主要特性的惡性骨腫瘤,骨肉瘤發(fā)病后進(jìn)展快、預(yù)后差,目前主要以手術(shù)治療為主,比如腫瘤關(guān)節(jié)的置換等保肢手術(shù)或截肢術(shù),以及相應(yīng)的放療化療等手段。但是骨肉瘤惡性程度高,對化療藥物不敏感,導(dǎo)致病人5年生存率即使應(yīng)用新的化療方案也不超過70%,單一手術(shù)更是不超過20%。并且骨肉瘤的另一特性：早期發(fā)生轉(zhuǎn)移,可于數(shù)月內(nèi)就發(fā)生肺轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致骨肉瘤病人一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移后即使應(yīng)用新的化療方案,5年生存率沒有明顯的提高,或者說沒有改變。這似乎形成了骨肉瘤治療的瓶頸,近年來對于骨肉瘤的治療逐漸形成了手術(shù)前化療然后盡量行保肢手術(shù),手術(shù)后給予化療的公認(rèn)的治療流程。但是對于病人的治療效果沒有進(jìn)一步的提高。所以大家逐漸把目光轉(zhuǎn)移到了骨肉瘤的病因?qū)W的研究上來,逐漸研究到分子水平。并且取得了很多的研究成果,比如發(fā)現(xiàn)了它的染色體突變,p21基因、INK4a/ARF基因等抑癌基因和HER2基因、BMI-1基因等癌基因發(fā)生突變導(dǎo)致了骨肉瘤的發(fā)生。以及這些基因所代表的細(xì)胞因子通過什么樣的機(jī)制比如導(dǎo)致一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的該表導(dǎo)致了骨肉瘤的發(fā)生等等。有人大體統(tǒng)計關(guān)于這方面的研究甚至達(dá)到了2萬多報道。但是所有的這些均沒有得到世界上所有相關(guān)學(xué)者的一致公論。近年來腫瘤干細(xì)胞理論被大家所關(guān)注,并且進(jìn)行了大量的研究,并且分離出了腫瘤干細(xì)胞,證明腫瘤干細(xì)胞是客觀存在的。本課題正是基于這一理論的基礎(chǔ)上進(jìn)行的設(shè)計實驗的。微小RNA (microRNA、miRNA)是一類近年來發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性多功能小分子RNA, miRNA首先在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn),成霖-4可以調(diào)控線蟲的順序發(fā)展。隨后的研究發(fā)現(xiàn),在水稻中,果蠅,線蟲,病毒,小鼠和人類中均存在miRNA。在一般情況下,miRNA是由19-25個核苷酸組成的具有高度保守特性的小分子,科學(xué)雜志認(rèn)為miRNA的發(fā)現(xiàn)是在2002年和2003年的十大科學(xué)進(jìn)展之一(Garajova et al.,2014; Luo et al.,2014)。目前確定的miRNA有4500多個。微RNA是屬于一類的非編碼RNA,其具有其中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用�；趍iRNA的高度保守的遺傳特性,它可以通過上調(diào)、或者下調(diào)靶基因的表達(dá)并且miRNA能抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá),使微RNA參與許多生物過程,諸如細(xì)胞增殖,分化和凋亡等。并且認(rèn)為它的主要作用機(jī)制就是與下游基因通過3’末端的完全或者不完全配對來影響下游基因的轉(zhuǎn)錄抑制翻譯等方式來起作用。miRNA的berant表達(dá)與各種癌癥的發(fā)展有關(guān),并且與不同種類的癌癥具有強(qiáng)的相關(guān)性。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及大家對它的認(rèn)識的不斷發(fā)展,miRNA的表達(dá)和生物學(xué)功能已在多種腫瘤都有研究。比如有miR-145對于乳腺癌來說可以起到抑癌基因的作用。同樣在肝癌中miR-122也同樣起著抑癌基因的作用但是miR-221/222卻起著癌基因的作用。鑒于他們在腫瘤中的重要作用,miRNA的被廣泛認(rèn)為是血液學(xué)和腫瘤組織的生物標(biāo)志物。并且其在骨腫瘤中的作用不斷的被研究,并且取得了很多的成果。MIR-184是一種新穎的miRNA,其在腫瘤中的作用仍不清楚。研究表明,它在不同腫瘤中的異常表達(dá),并可調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生。最近的研究表明,micro 184在多種腫瘤中的異常表達(dá),可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長,分化,侵襲,轉(zhuǎn)移(Wong et al.,2009; Cui et al.,2014; Gao et al., 2014)。并且有的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)它還可以誘導(dǎo)新生血管的形成。它在有的腫瘤中起著癌基因的作用,比如有人通過研究認(rèn)為它可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生并增加其侵襲性。然而在腎癌中,它卻可以明顯的抑制腎癌細(xì)胞的生長、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,并可以明顯的抑制腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移浸潤。目的：體外培養(yǎng)購買來自ATCC細(xì)胞庫的大鼠骨肉瘤細(xì)胞株(SOSP-M),通過細(xì)胞的傳代培養(yǎng)并經(jīng)過免疫組化檢測合格后,使用Trizol法提取RNA后,應(yīng)用引物經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用實時定量檢測PCR方法檢測miR-184的表達(dá),首先檢驗miR-184抑制劑和模擬劑對miR-184在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)的影響。在確定miR-184模擬劑和抑制劑對miR-184在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義的影響后,應(yīng)用MTT法,研究對照組及應(yīng)用miR-184模擬劑和抑制劑及A、B、C組骨肉瘤細(xì)胞的增殖情況來檢測miR-184對骨肉瘤細(xì)胞增殖性的影響,然后應(yīng)用Transwell法,研究研究對照組及應(yīng)用miR-184模擬劑和抑制劑及A、B、C組骨肉瘤細(xì)胞侵襲性的改變來檢測miR-184對骨肉瘤細(xì)胞侵襲性的影響,研究miR-184對骨肉瘤細(xì)胞的增殖性及侵襲性的影響是否有統(tǒng)計學(xué)意義。最終通過驗證期miR-184對骨肉瘤細(xì)胞的作用,確認(rèn)miR-184對骨肉瘤細(xì)胞的增殖性及侵襲性有正向作用,即miR-184可以促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖,并且可以增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲性,希望能夠為骨肉瘤的治療提供一種新的生物靶標(biāo),能夠為骨肉瘤的治療提供一種新的手段。方法：第一部分：參考國內(nèi)外對骨肉瘤細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)方法,通過將骨肉瘤細(xì)胞復(fù)蘇、傳代等技術(shù)體外培養(yǎng)大鼠骨肉瘤細(xì)胞(SOSP-M).并且經(jīng)過免疫組織化學(xué)的檢測,檢測合格后,將對數(shù)生長期的細(xì)胞分為三組：正常對照組(A組),應(yīng)用MIR-184模仿劑組(B組),和應(yīng)用MIR-184抑制劑組(C組)。然后將MIR-184模擬劑和MIR-184抑制劑分別轉(zhuǎn)染到B、C組中,應(yīng)用Trizol法提取RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,應(yīng)用實時定量PCR方法檢測MIR-184的表達(dá),應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)分析,應(yīng)用MIR-184模仿劑和抑制劑后對MIR-184的表達(dá)是否有統(tǒng)計學(xué)意義。檢驗MIR-184模擬劑和抑制劑的有效性。實驗重復(fù)三次。第二部分：主要是應(yīng)用RNA干擾技術(shù),細(xì)胞培養(yǎng)傳代技術(shù)同上。將對數(shù)生長期的細(xì)胞分為三組,應(yīng)用Trizol法提取RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。所用的引物是通過PrimerPrimier6.0設(shè)計和生工合成�；虮磉_(dá)水平使用優(yōu)化的比較Ct(△△CT)值法進(jìn)行定量。應(yīng)用實時定量PCR方法檢測MIR-184的表達(dá),應(yīng)用MTT比色法,將細(xì)胞分為三組,即正常對照組(A組),應(yīng)用MIR-184模仿劑組(B組),和應(yīng)用MIR-184抑制劑組(C組),根據(jù)骨肉瘤細(xì)胞的增殖情況,檢測MIR-184對骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響。實驗重復(fù)三次,并計算細(xì)胞增值率。第三部分：細(xì)胞培養(yǎng)傳代技術(shù)同上�；虻奶崛『蛿U(kuò)增方法同上。應(yīng)用實時定量PCR方法檢測MIR-184的表達(dá),用Transwell檢測方法檢測骨肉瘤侵襲能力的變化,也是將細(xì)胞分為三組,即正常對照組(A組),應(yīng)用MIR-184模仿劑組(B組),和應(yīng)用MIR-184抑制劑組(C組),將10個視野中遷移到膜的下游的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù),檢測MIR-184對骨肉瘤在應(yīng)用MIR-184模擬劑及MIR-184被抑制后侵襲性的變化情況。實驗重復(fù)三次。統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析(Chicago, IL, USA).。數(shù)據(jù)被表示為平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(±SD),采用單因素方差分析或配對t檢驗分析方法間的差異性,P值小于0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義結(jié)果：(1)相差顯微鏡下形態(tài)觀察SOSP-M傳3-4代后幾呈單一的梭形細(xì)胞,并且培養(yǎng)細(xì)胞95%以上為GFAP染色陽性細(xì)胞。(2)在與對照組相比中,miR-184的表達(dá)在miR-184模擬劑組(B組)顯著增加(P0.05)。miR-184的表達(dá)在miR-184抑制劑組(C組),miR-184表達(dá)明顯減少(P0.05),(3)在與對照組相比中,在miR-184模擬組(B組)骨肉瘤細(xì)胞的增殖被顯著增強(qiáng)(P0.05),然而在miR-184抑制組(C組)骨肉瘤細(xì)胞的增殖被顯著抑制(P0.05),(4)在與對照組相比中,在miR-184模擬組(B組)骨肉瘤細(xì)胞的浸潤能力明顯增加(P0.05),然而在miR-184抑制組(C組)骨肉瘤細(xì)胞的侵蝕能力明顯下降(P0.05)。結(jié)論：(1)本實驗骨肉瘤細(xì)胞經(jīng)過傳代后實驗可靠有效,(2)miR-184的模擬劑和抑制劑可以明顯增強(qiáng)和抑制miR-184在大鼠骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)(3)miR-184的表達(dá)在被模擬劑增強(qiáng)后可以顯著增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的增殖,并且miR-184的表達(dá)在被miR-184抑制劑抑制后骨肉瘤細(xì)胞的增殖性明顯降低,證明骨肉瘤細(xì)胞的增殖性被抑制。(4)miR-184的表達(dá)在被模擬劑增強(qiáng)后可以顯著增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞的侵襲性,并且骨肉瘤細(xì)胞的侵襲性在miR-184的表達(dá)被miR-184抑制劑抑制后明顯降低(5)本實驗研究表明miR-184直接參與了骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān),并參與了骨肉瘤轉(zhuǎn)移。MIR-184參與了骨肉瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移的調(diào)控,并可能代表在臨床上診斷骨肉瘤的臨床標(biāo)記物,并且有可能是治療轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的新的治療靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1

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本文編號：1570872