本文選題：泛素連接酶　切入點：黑素瘤　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分泛素連接酶Cbl-b在皮膚黑素瘤組織和細胞系中的表達及意義目的:探討泛素連接酶Cbl-b在黑素瘤細胞系A375、M14、MV3和黑素瘤組織中表達情況,并分析其與黑素瘤臨床病理特征的相關性。方法:通過免疫組織化學方法檢測Cbl-b蛋白在69例皮膚黑素瘤組織及30例色素痣表達,并分析其與皮膚黑素瘤臨床病理特征相關性。QPCR、細胞免疫熒光、Western blot檢測Cbl-b在黑素瘤細胞系A375、M14、MV3及黑素細胞中mRNA及蛋白水平。結(jié)果:免疫組化發(fā)現(xiàn)Cbl-b在69例皮膚黑素瘤和30例色素痣中分別有52例(75.36%)和4例陽性(13.33%),兩組差異有統(tǒng)計學意義(x2=32.745,p0.01)。Cbl-b表達與皮膚黑素瘤相關預后因素,如腫瘤進展、Clark分級和Breslow厚度呈顯著正相關(rs=0.569;rs=0.654;rs=0.727,p值均0.01)。潰瘍組Cbl-b表達顯著高于非潰瘍組(p0.01)。QPCR示Cbl-b在黑素細胞及黑素瘤細胞株A375、M14、MV3mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(F=176.537,p0.01)。細胞免疫熒光、免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)皮膚黑素瘤細胞株Cbl-b表達均高于正常黑素細胞,以A375表達水平最高。結(jié)論:皮膚黑素瘤和其細胞株均高表達Cbl-b蛋白,說明Cbl-b可能在皮膚黑素瘤發(fā)病過程中起正性調(diào)控作用。第二部分泛素連接酶Cbl-b基因shRNA慢病毒載體構(gòu)建及其對黑素瘤A375細胞生物學行為影響目的:構(gòu)建泛素連接酶Cbl-b基因shRNA慢病毒載體,并研究其對黑素瘤A375細胞生物學行為影響。方法:設計并合成3條沉默Cbl-b基因的特異性shRNA,構(gòu)建慢病毒載體轉(zhuǎn)染黑素瘤A375細胞。應用QPCR和Western blot篩選沉默效率最高重組慢病毒載體。CCK8法檢測細胞增殖能力,流式細胞儀檢測細胞凋亡、細胞周期,Transwell法檢測細胞侵襲能力。結(jié)果:成功構(gòu)建3條Cbl-b shRNA慢病毒載體。QPCR和Western blot發(fā)現(xiàn)CBLB-shRNA-3沉默效率最高。CCK8檢測表明CBLB-shRNA-3組細胞增殖能力在72h和96h較陰性對照組、空白對照組明顯減低(p0.01)。流式細胞儀檢測示CBLB-shRNA-3組凋亡率(22.73±6.58)%明顯高于陰性對照組(6.08±1.35)%和空白對照組(6.34±1.07)%(p0.01)。CBLB-shRNA-3組G1期細胞比例明顯高于陰性對照組、空白對照組(p0.01),而S期細胞比例明顯低于陰性對照組、空白對照組(p0.01),表明細胞發(fā)生了 G1期阻滯。Transwell檢測結(jié)果示陰性對照組、空白對照組和CBLB-shRNA-3組72h時穿膜細胞數(shù)分別為(76.60±1.82)個,(73.20±3.83)個,(19.60±1.14)個,CBLB-shRNA-3組明顯低于陰性對照組、空白對照組(p0.01)。結(jié)論:成功構(gòu)建高效沉默Cbl-b基因的CBLB-shRNA-3 shRNA重組慢病毒載體,沉默Cbl-b可抑制黑素瘤A375細胞增殖、細胞周期和侵襲能力,促進細胞凋亡。第三部分應用蛋白質(zhì)組學分析Cbl-b在黑素瘤細胞A375中相關蛋白目的:分析Cbl-b在黑素瘤細胞A375中相關蛋白。方法:使用非標記定量蛋白質(zhì)組學技術鑒定Cbl-b shRNA組A375細胞株及陰性對照A375細胞株差異蛋白表達。采用生物信息學方法對差異蛋白進行分析。利用Western blot驗證部分差異蛋白(EphA2、GSK3 β)表達和Cbl-b shRNA干擾后p-AKT表達。結(jié)果:本次試驗共鑒定3449種蛋白,其中差異表達蛋白質(zhì)74個,Cbl-b shRNA組相對陰性對照組上調(diào)蛋白52個,下調(diào)蛋白22個。聚類分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白可有效區(qū)分樣本。GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要生物學過程包括:整合素介導的細胞粘附、單一生物代謝過程、整合素介導的細胞粘附調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)靶向線粒體、核苷酸代謝進程;主要分子功能包括:DNA結(jié)合、2,2鐵硫簇合物結(jié)合、信號受體活性、鈣粘蛋白結(jié)合。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)通路主要包括:葉酸生物合成、軸突導向、細胞外基質(zhì)受體相互作用、黏合連接、Wnt信號通路、Hippo信號通路、葉酸拮抗劑抵抗、氧化磷酸化、PI3K-Akt信號通路等。Western blot驗證差異蛋白EphA2、GSK3 β表達與蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致。Cbl-b shRNA干擾A375細胞后p-AKT水平降低。結(jié)論:Cbl-b可能通過多種生物學通路參與黑素瘤發(fā)病。EphA2/PI3K/AKT信號通路可能是Cbl-b參與黑素瘤形成的重要機制之一。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.5

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本文編號：1568857