本文選題：PTEN　切入點(diǎn)：OTUD3　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：PTEN是1997年在人類10號(hào)染色體上首次發(fā)現(xiàn)并克隆到的一個(gè)抑癌基因,通過20多年的研究發(fā)現(xiàn)PTEN在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的抑制作用。PTEN基因的生殖突變與體細(xì)胞突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。作為一個(gè)抑癌基因PTEN在多種腫瘤中(例如子宮內(nèi)膜癌,惡性膠質(zhì)瘤,前列腺癌,乳腺癌,結(jié)腸癌以及肺癌)存在雜合缺失或者突變。在腫瘤易感性疾病例如Cowden或者Bannayan-Zonana綜合癥中也常發(fā)現(xiàn)PTEN基因的遺傳突變。PTEN基因雜合缺失小鼠自發(fā)形成多種腫瘤,而純合缺失小鼠死于胚胎期的9.5天。PTEN具有脂質(zhì)和蛋白雙重磷酸酶活性,它利用脂質(zhì)磷酸酶活性將細(xì)胞質(zhì)中的磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸去磷酸化生成磷脂酰肌醇4,5二磷酸,從而抑制PI3K-Akt通路。同時(shí)PTEN也可以利用其非磷酸化酶功能在核內(nèi)以不依賴PI3K-Akt通路的方式來(lái)發(fā)揮功能。PTEN蛋白劑量水平的精細(xì)變化就與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。與傳統(tǒng)的抑癌因子不同,PTEN的功能發(fā)揮是連續(xù)性的,也就是說PTEN的抑癌功能并不依賴基因拷貝數(shù)的改變而出現(xiàn)跳躍式變化。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)小鼠體內(nèi)PTEN水平維持在80%時(shí),乳腺癌的發(fā)生率就高達(dá)40%,因此PTEN蛋白的穩(wěn)定性調(diào)控至關(guān)重要。既然PTEN的蛋白水平的精細(xì)變化就與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),那么機(jī)體一定存在一套嚴(yán)格的監(jiān)管系統(tǒng)來(lái)維持PTEN的蛋白穩(wěn)定性。與抑癌蛋白p53不同,p53在細(xì)胞內(nèi)的蛋白水平低,半衰期短,而PTEN則具有相對(duì)較長(zhǎng)的半衰期和較高的內(nèi)源表達(dá)水平。那么一個(gè)重要科學(xué)問題就是在生物體內(nèi)PTEN的強(qiáng)穩(wěn)定性如何被維持呢?蛋白質(zhì)的翻譯后修飾是維持蛋白穩(wěn)定性的主要途徑。其中泛素-蛋白酶體途徑是生物體內(nèi)最主要的蛋白質(zhì)水平調(diào)控途徑,泛素連接酶與去泛素化酶共同調(diào)控蛋白穩(wěn)定性的平衡。目前報(bào)道的PTEN泛素連接酶共有5個(gè),Nedd4-1,WWP2,XIAP,CHIP和TRIM27。許多蛋白的泛素化修飾都可以被去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)所逆轉(zhuǎn)。人類基因組中大約有90個(gè)DUB分子。然而,對(duì)PTEN的去泛素化修飾還知之甚少。2008年Nature雜志報(bào)道位于細(xì)胞核的HAUSP可以去除PTEN的單泛素化修飾從而介導(dǎo)PTEN從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。但是HAUSP對(duì)PTEN的蛋白穩(wěn)定性卻沒有影響。因此在我們的研究工作開展時(shí),能夠特異去除PTEN的多聚泛素化維持其蛋白穩(wěn)定性的DUB分子仍未被鑒定到。本課題的研究目的就是鑒定能夠去除PTEN多聚泛素化促進(jìn)PTEN穩(wěn)定的DUB分子,同時(shí)研究其生理病理功能。針對(duì)鑒定能促進(jìn)PTEN穩(wěn)定的DUB分子這一科學(xué)問題,我們通過對(duì)全部人源DUB家族成員進(jìn)行無(wú)偏向性篩選,發(fā)現(xiàn)OTU亞家族中的OTUD3(OTU domain-containing protein 3)分子可以顯著地上調(diào)PTEN的蛋白水平。OTUD3定位于人類染色體1p36.13,是一個(gè)迄今為止研究極少的基因。通過我們的研究目前獲得的主要數(shù)據(jù)有:(1)OTUD3作為PTEN的去泛素化酶調(diào)控PTEN的蛋白穩(wěn)定性。OTUD3主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,N端的OTU結(jié)構(gòu)域直接參與PTEN的C2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合,通過去除PTEN的多聚泛素化修飾、拮抗PTEN的泛素蛋白酶體降解,從而穩(wěn)定PTEN的蛋白水平。敲低細(xì)胞內(nèi)源OTUD3的表達(dá),PTEN的蛋白穩(wěn)定性顯著下降,Akt通路被過度激活;在細(xì)胞中過表達(dá)野生型OTUD3,PTEN的半衰期延長(zhǎng),PI3K-Akt通路受到抑制。(2)OTUD3的功能。首先,裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明在乳腺癌細(xì)胞系中過表達(dá)野生型OTUD3而非酶活突變型C76A可以抑制腫瘤的形成。相反,在乳腺癌細(xì)胞系中敲低內(nèi)源OTUD3的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。而在正常乳腺上皮細(xì)胞中敲低內(nèi)源OTUD3的表達(dá)會(huì)使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,在裸鼠皮下注射該細(xì)胞可形成腫瘤。其次,在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、肺癌細(xì)胞系Hep G2以及子宮頸癌細(xì)胞系He La中敲低內(nèi)源OTUD3的表達(dá),會(huì)促進(jìn)腫瘤的形成并且會(huì)促進(jìn)腫瘤的肝或者肺轉(zhuǎn)移,這說明OTUD3的抑癌功能并不僅僅局限于乳腺癌。最后,我們成功構(gòu)建了OTUD3的轉(zhuǎn)基因小鼠模型以及基因敲除小鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在OTUD3轉(zhuǎn)基因小鼠的多種組織器官以及MEF細(xì)胞中PTEN都呈高表達(dá),PTEN的穩(wěn)定性增強(qiáng),泛素化水平顯著降低,Akt通路受到抑制,而基因敲除小鼠的表型與之相反。MMTV-Py MT轉(zhuǎn)基因小鼠可以自發(fā)形成乳腺癌,是常用于乳腺癌研究的小鼠模型,為了在體內(nèi)研究OTUD3的抑癌功能,我們將OTUD3轉(zhuǎn)基因小鼠與MMTV-Py MT轉(zhuǎn)基因小鼠交配。結(jié)果顯示OTUD3轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)MMTV-Py MT誘導(dǎo)的乳腺癌發(fā)生表現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)。這從遺傳學(xué)上充分證明OTUD3是PTEN的一個(gè)重要的穩(wěn)定調(diào)控因子,在體內(nèi)OTUD3發(fā)揮著重要的抑癌功能。(3)OTUD3與乳腺癌的關(guān)系。我們通過大規(guī)模臨床乳腺癌病人樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,OTUD3在乳腺癌組織(PTEN基因的突變率低)中低表達(dá),并且PTEN的蛋白水平與OTUD3的表達(dá)呈正相關(guān)性。且OTUD3的表達(dá)與病人的預(yù)后有明顯相關(guān)性。OTUD3表達(dá)高,病人出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的概率越小,生存期越長(zhǎng),預(yù)后越好。同時(shí)在乳腺癌中OTUD3和PTEN存在基因突變,OTUD3的突變體喪失了對(duì)PTEN的去泛素化修飾能力,在正常乳腺上皮細(xì)胞中過表達(dá)OTUD3-E86K突變體也會(huì)促進(jìn)腫瘤的形成,說明E86K突變將OTUD3從一個(gè)抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗�。這與抑癌因子PTEN和p53相似。而PTEN的突變體卻喪失了與OTUD3的相互作用能力,從而失去了OTUD3的保護(hù),結(jié)果導(dǎo)致PTEN蛋白的不穩(wěn)定。我們的研究表明OTUD3分子是PTEN重要的正調(diào)控因子,OTUD3-PTEN通路在腫瘤的抑制過程中發(fā)揮著重要作用。總之,我們的研究回答了PTEN領(lǐng)域中一個(gè)長(zhǎng)期沒有解決的重大問題,彌補(bǔ)了通過拮抗泛素化降解從而促進(jìn)對(duì)PTEN穩(wěn)定性調(diào)控這一機(jī)制長(zhǎng)期未被解決的缺憾。OTUD3基因定位于人類染色體1p36.13,該區(qū)在乳腺癌中常發(fā)生缺失,同時(shí)該區(qū)與腫瘤的轉(zhuǎn)移,預(yù)后差以及易復(fù)發(fā)等特性密切相關(guān)。通過研究我們發(fā)現(xiàn)OTUD3也是位于這一區(qū)域的一個(gè)重要的候選抑癌基因。冠狀病毒跟呼吸道、腸、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。然而直到二十世紀(jì)60年代,冠狀病毒都沒有被發(fā)現(xiàn)是引起人類疾病的病原體,直到2003SARS病毒在全世界的大爆發(fā)和蔓延,引起人類的大恐慌,冠狀病毒才得到全球的關(guān)注。SARS冠狀病毒在全球32個(gè)國(guó)家蔓延感染了8000多人,致死率高達(dá)10%。SARS疫情控制以后,科學(xué)家們加大了對(duì)冠狀病毒的研究發(fā)現(xiàn)了另一支冠狀病毒NL63。研究表明有7%的住院病人感染NL63,感染的小孩和大人常出現(xiàn)上呼吸道以及下呼吸道感染、支氣管炎、以及結(jié)膜炎。但是很遺憾到目前為止還沒有有效的抗病毒藥物來(lái)治療冠狀病毒感染。冠狀病毒感染宿主細(xì)胞后,病毒RNA編碼兩類較大的融合蛋白pp1a和pp1ab,這些融合蛋白被病毒半胱氨酸蛋白酶(PLPs/PLpro/3CLpro)切割成成熟的非結(jié)構(gòu)性蛋白。NL63病毒編碼兩類半胱氨酸蛋白酶PLP1和PLP2來(lái)切割病毒復(fù)制酶,病毒復(fù)制酶常常在病毒感染24小時(shí)后就能被檢測(cè)到。前期研究表明PLP2蛋白具有去泛素化酶活性,而且能抑制宿主細(xì)胞Ⅰ型干擾素的表達(dá)。Ⅰ型干擾素能夠很好的抑制冠狀病毒的復(fù)制增殖,而且IFN-β的效果比IFN-α好。然而臨床研究表明冠狀病毒感染只會(huì)激發(fā)宿主細(xì)胞產(chǎn)生極低濃度的Ⅰ型干擾素,從而宿主細(xì)胞只能產(chǎn)生微弱的免疫應(yīng)答導(dǎo)致導(dǎo)致病毒瘋狂復(fù)制。但是這其中具體的調(diào)控機(jī)制到目前還不是很清楚。自1979年P(guān)53基因被首次克隆鑒定起,科學(xué)家們就投入了大量的精力去探索P53基因的功能,并發(fā)現(xiàn)該基因在維持基因組的穩(wěn)定性以及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。但是,P53基因的功能“多樣性”使得它總能給我們帶來(lái)新的驚喜。最近的研究表明p53是Ⅰ型干擾素(IFNα/β)通路直接的靶基因,在病毒感染時(shí)一些細(xì)胞因子可以激活p53的表達(dá)。這表明p53在抗病毒先天免疫中發(fā)揮著功能。由于病毒感染可以激活p53通路,因此p53分子被認(rèn)為是宿主細(xì)胞抵抗病毒感染的新成員。事實(shí)上,p53在介導(dǎo)感染細(xì)胞的凋亡以及誘發(fā)Ⅰ型干擾素合成中發(fā)揮著重要作用。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明p53可以抑制很多病毒的復(fù)制增殖。p53在抗病毒先天免疫中的功能能夠很好的解釋為什么P53基因在壽命很短的簡(jiǎn)單原生動(dòng)物中就存在,而在這些原始生命中P53基因根本不需要承擔(dān)抑制組織細(xì)胞生長(zhǎng)失控的責(zé)任(例如腫瘤的發(fā)生),以及為什么p53常是病毒蛋白的作用靶點(diǎn)。但是我們不得不承認(rèn)p53在抗病毒免疫調(diào)控中的研究還非常有限,p53在其中的具體調(diào)控機(jī)理還不是非常明確。P53在免疫調(diào)控領(lǐng)域的研究還有很長(zhǎng)的路要走。我們的研究發(fā)現(xiàn)NL63編碼的木瓜樣蛋白酶PLP2通過對(duì)MDM2的去泛素化修飾來(lái)穩(wěn)定其蛋白穩(wěn)定性,進(jìn)而促進(jìn)p53的降解以及抑制其轉(zhuǎn)錄因子活性,從而抑制病毒感染所引起的IFN-β的轉(zhuǎn)錄激活以及細(xì)胞凋亡,最后抵抗宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)導(dǎo)致病毒在宿主細(xì)胞體內(nèi)大量增殖。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)IRF7是p53直接的靶基因,在免疫應(yīng)答過程中p53轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)RF7的表達(dá)。我們的工作深入研究了p53在宿主細(xì)胞抵抗病毒感染的先天免疫調(diào)控中的功能及其作用機(jī)制,并且探索了病毒蛋白PLP2在抵抗宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制。本研究不僅具有重要的科學(xué)意義,而且將為病毒的臨床治療與預(yù)防提供重要的參考。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1561705