本文選題：PTEN　切入點：OTUD3　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：PTEN是1997年在人類10號染色體上首次發(fā)現(xiàn)并克隆到的一個抑癌基因,通過20多年的研究發(fā)現(xiàn)PTEN在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的抑制作用。PTEN基因的生殖突變與體細胞突變與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。作為一個抑癌基因PTEN在多種腫瘤中(例如子宮內(nèi)膜癌,惡性膠質瘤,前列腺癌,乳腺癌,結腸癌以及肺癌)存在雜合缺失或者突變。在腫瘤易感性疾病例如Cowden或者Bannayan-Zonana綜合癥中也常發(fā)現(xiàn)PTEN基因的遺傳突變。PTEN基因雜合缺失小鼠自發(fā)形成多種腫瘤,而純合缺失小鼠死于胚胎期的9.5天。PTEN具有脂質和蛋白雙重磷酸酶活性,它利用脂質磷酸酶活性將細胞質中的磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸去磷酸化生成磷脂酰肌醇4,5二磷酸,從而抑制PI3K-Akt通路。同時PTEN也可以利用其非磷酸化酶功能在核內(nèi)以不依賴PI3K-Akt通路的方式來發(fā)揮功能。PTEN蛋白劑量水平的精細變化就與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。與傳統(tǒng)的抑癌因子不同,PTEN的功能發(fā)揮是連續(xù)性的,也就是說PTEN的抑癌功能并不依賴基因拷貝數(shù)的改變而出現(xiàn)跳躍式變化。研究發(fā)現(xiàn)當小鼠體內(nèi)PTEN水平維持在80%時,乳腺癌的發(fā)生率就高達40%,因此PTEN蛋白的穩(wěn)定性調控至關重要。既然PTEN的蛋白水平的精細變化就與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,那么機體一定存在一套嚴格的監(jiān)管系統(tǒng)來維持PTEN的蛋白穩(wěn)定性。與抑癌蛋白p53不同,p53在細胞內(nèi)的蛋白水平低,半衰期短,而PTEN則具有相對較長的半衰期和較高的內(nèi)源表達水平。那么一個重要科學問題就是在生物體內(nèi)PTEN的強穩(wěn)定性如何被維持呢?蛋白質的翻譯后修飾是維持蛋白穩(wěn)定性的主要途徑。其中泛素-蛋白酶體途徑是生物體內(nèi)最主要的蛋白質水平調控途徑,泛素連接酶與去泛素化酶共同調控蛋白穩(wěn)定性的平衡。目前報道的PTEN泛素連接酶共有5個,Nedd4-1,WWP2,XIAP,CHIP和TRIM27。許多蛋白的泛素化修飾都可以被去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)所逆轉。人類基因組中大約有90個DUB分子。然而,對PTEN的去泛素化修飾還知之甚少。2008年Nature雜志報道位于細胞核的HAUSP可以去除PTEN的單泛素化修飾從而介導PTEN從細胞核轉移到細胞質中。但是HAUSP對PTEN的蛋白穩(wěn)定性卻沒有影響。因此在我們的研究工作開展時,能夠特異去除PTEN的多聚泛素化維持其蛋白穩(wěn)定性的DUB分子仍未被鑒定到。本課題的研究目的就是鑒定能夠去除PTEN多聚泛素化促進PTEN穩(wěn)定的DUB分子,同時研究其生理病理功能。針對鑒定能促進PTEN穩(wěn)定的DUB分子這一科學問題,我們通過對全部人源DUB家族成員進行無偏向性篩選,發(fā)現(xiàn)OTU亞家族中的OTUD3(OTU domain-containing protein 3)分子可以顯著地上調PTEN的蛋白水平。OTUD3定位于人類染色體1p36.13,是一個迄今為止研究極少的基因。通過我們的研究目前獲得的主要數(shù)據(jù)有:(1)OTUD3作為PTEN的去泛素化酶調控PTEN的蛋白穩(wěn)定性。OTUD3主要定位于細胞質中,N端的OTU結構域直接參與PTEN的C2結構域的結合,通過去除PTEN的多聚泛素化修飾、拮抗PTEN的泛素蛋白酶體降解,從而穩(wěn)定PTEN的蛋白水平。敲低細胞內(nèi)源OTUD3的表達,PTEN的蛋白穩(wěn)定性顯著下降,Akt通路被過度激活;在細胞中過表達野生型OTUD3,PTEN的半衰期延長,PI3K-Akt通路受到抑制。(2)OTUD3的功能。首先,裸鼠成瘤實驗表明在乳腺癌細胞系中過表達野生型OTUD3而非酶活突變型C76A可以抑制腫瘤的形成。相反,在乳腺癌細胞系中敲低內(nèi)源OTUD3的表達可以促進腫瘤細胞的轉移。而在正常乳腺上皮細胞中敲低內(nèi)源OTUD3的表達會使細胞發(fā)生轉化,在裸鼠皮下注射該細胞可形成腫瘤。其次,在結腸癌細胞系HCT116、肺癌細胞系Hep G2以及子宮頸癌細胞系He La中敲低內(nèi)源OTUD3的表達,會促進腫瘤的形成并且會促進腫瘤的肝或者肺轉移,這說明OTUD3的抑癌功能并不僅僅局限于乳腺癌。最后,我們成功構建了OTUD3的轉基因小鼠模型以及基因敲除小鼠模型。結果發(fā)現(xiàn)在OTUD3轉基因小鼠的多種組織器官以及MEF細胞中PTEN都呈高表達,PTEN的穩(wěn)定性增強,泛素化水平顯著降低,Akt通路受到抑制,而基因敲除小鼠的表型與之相反。MMTV-Py MT轉基因小鼠可以自發(fā)形成乳腺癌,是常用于乳腺癌研究的小鼠模型,為了在體內(nèi)研究OTUD3的抑癌功能,我們將OTUD3轉基因小鼠與MMTV-Py MT轉基因小鼠交配。結果顯示OTUD3轉基因小鼠對MMTV-Py MT誘導的乳腺癌發(fā)生表現(xiàn)出顯著的抑制效應。這從遺傳學上充分證明OTUD3是PTEN的一個重要的穩(wěn)定調控因子,在體內(nèi)OTUD3發(fā)揮著重要的抑癌功能。(3)OTUD3與乳腺癌的關系。我們通過大規(guī)模臨床乳腺癌病人樣本檢測發(fā)現(xiàn),與癌旁組織相比,OTUD3在乳腺癌組織(PTEN基因的突變率低)中低表達,并且PTEN的蛋白水平與OTUD3的表達呈正相關性。且OTUD3的表達與病人的預后有明顯相關性。OTUD3表達高,病人出現(xiàn)淋巴結轉移的概率越小,生存期越長,預后越好。同時在乳腺癌中OTUD3和PTEN存在基因突變,OTUD3的突變體喪失了對PTEN的去泛素化修飾能力,在正常乳腺上皮細胞中過表達OTUD3-E86K突變體也會促進腫瘤的形成,說明E86K突變將OTUD3從一個抑癌基因轉變?yōu)榘┗�。這與抑癌因子PTEN和p53相似。而PTEN的突變體卻喪失了與OTUD3的相互作用能力,從而失去了OTUD3的保護,結果導致PTEN蛋白的不穩(wěn)定。我們的研究表明OTUD3分子是PTEN重要的正調控因子,OTUD3-PTEN通路在腫瘤的抑制過程中發(fā)揮著重要作用。總之,我們的研究回答了PTEN領域中一個長期沒有解決的重大問題,彌補了通過拮抗泛素化降解從而促進對PTEN穩(wěn)定性調控這一機制長期未被解決的缺憾。OTUD3基因定位于人類染色體1p36.13,該區(qū)在乳腺癌中常發(fā)生缺失,同時該區(qū)與腫瘤的轉移,預后差以及易復發(fā)等特性密切相關。通過研究我們發(fā)現(xiàn)OTUD3也是位于這一區(qū)域的一個重要的候選抑癌基因。冠狀病毒跟呼吸道、腸、肝臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關。然而直到二十世紀60年代,冠狀病毒都沒有被發(fā)現(xiàn)是引起人類疾病的病原體,直到2003SARS病毒在全世界的大爆發(fā)和蔓延,引起人類的大恐慌,冠狀病毒才得到全球的關注。SARS冠狀病毒在全球32個國家蔓延感染了8000多人,致死率高達10%。SARS疫情控制以后,科學家們加大了對冠狀病毒的研究發(fā)現(xiàn)了另一支冠狀病毒NL63。研究表明有7%的住院病人感染NL63,感染的小孩和大人常出現(xiàn)上呼吸道以及下呼吸道感染、支氣管炎、以及結膜炎。但是很遺憾到目前為止還沒有有效的抗病毒藥物來治療冠狀病毒感染。冠狀病毒感染宿主細胞后,病毒RNA編碼兩類較大的融合蛋白pp1a和pp1ab,這些融合蛋白被病毒半胱氨酸蛋白酶(PLPs/PLpro/3CLpro)切割成成熟的非結構性蛋白。NL63病毒編碼兩類半胱氨酸蛋白酶PLP1和PLP2來切割病毒復制酶,病毒復制酶常常在病毒感染24小時后就能被檢測到。前期研究表明PLP2蛋白具有去泛素化酶活性,而且能抑制宿主細胞Ⅰ型干擾素的表達。Ⅰ型干擾素能夠很好的抑制冠狀病毒的復制增殖,而且IFN-β的效果比IFN-α好。然而臨床研究表明冠狀病毒感染只會激發(fā)宿主細胞產(chǎn)生極低濃度的Ⅰ型干擾素,從而宿主細胞只能產(chǎn)生微弱的免疫應答導致導致病毒瘋狂復制。但是這其中具體的調控機制到目前還不是很清楚。自1979年P53基因被首次克隆鑒定起,科學家們就投入了大量的精力去探索P53基因的功能,并發(fā)現(xiàn)該基因在維持基因組的穩(wěn)定性以及細胞周期和細胞凋亡調控中發(fā)揮著重要作用。但是,P53基因的功能“多樣性”使得它總能給我們帶來新的驚喜。最近的研究表明p53是Ⅰ型干擾素(IFNα/β)通路直接的靶基因,在病毒感染時一些細胞因子可以激活p53的表達。這表明p53在抗病毒先天免疫中發(fā)揮著功能。由于病毒感染可以激活p53通路,因此p53分子被認為是宿主細胞抵抗病毒感染的新成員。事實上,p53在介導感染細胞的凋亡以及誘發(fā)Ⅰ型干擾素合成中發(fā)揮著重要作用。體內(nèi)體外實驗表明p53可以抑制很多病毒的復制增殖。p53在抗病毒先天免疫中的功能能夠很好的解釋為什么P53基因在壽命很短的簡單原生動物中就存在,而在這些原始生命中P53基因根本不需要承擔抑制組織細胞生長失控的責任(例如腫瘤的發(fā)生),以及為什么p53常是病毒蛋白的作用靶點。但是我們不得不承認p53在抗病毒免疫調控中的研究還非常有限,p53在其中的具體調控機理還不是非常明確。P53在免疫調控領域的研究還有很長的路要走。我們的研究發(fā)現(xiàn)NL63編碼的木瓜樣蛋白酶PLP2通過對MDM2的去泛素化修飾來穩(wěn)定其蛋白穩(wěn)定性,進而促進p53的降解以及抑制其轉錄因子活性,從而抑制病毒感染所引起的IFN-β的轉錄激活以及細胞凋亡,最后抵抗宿主細胞的免疫應答反應導致病毒在宿主細胞體內(nèi)大量增殖。同時我們發(fā)現(xiàn)IRF7是p53直接的靶基因,在免疫應答過程中p53轉錄激活IRF7的表達。我們的工作深入研究了p53在宿主細胞抵抗病毒感染的先天免疫調控中的功能及其作用機制,并且探索了病毒蛋白PLP2在抵抗宿主抗病毒天然免疫反應中的作用機制。本研究不僅具有重要的科學意義,而且將為病毒的臨床治療與預防提供重要的參考。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.5

【共引文獻】

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