本文選題：CCL2　切入點(diǎn)：Kif4A　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腫瘤(tumor)是機(jī)體在多重致癌因素作用下,特定組織中某種細(xì)胞失去正‘常生長調(diào)控能力,進(jìn)而發(fā)展為異常性無限增生的病變現(xiàn)象。腫瘤的發(fā)生進(jìn)展與腫瘤細(xì)胞自身及其所處的局部環(huán)境密切相關(guān)。一方面,腫瘤細(xì)胞通過自我突變以及蛋白修飾等方法對宿主免疫系統(tǒng)識別的靶點(diǎn)加以隱蔽或丟棄,從而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視；另一方面,腫瘤細(xì)胞通過編織復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),形成特定腫瘤微環(huán)境,為其迅速增殖、持續(xù)化的新血管生成以及侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移提供適宜的土壤。目前研究廣泛認(rèn)為：腫瘤微環(huán)境為腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等行為提供外在保障。旨在通過打破該微環(huán)境從而達(dá)到干預(yù)腫瘤生長及進(jìn)展的治療策略正愈發(fā)受到關(guān)注。與腫瘤微環(huán)境相似,妊娠早期母胎界面同樣維持免疫耐受微環(huán)境從而有利于胚胎成功植入母體子宮。胚胎來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞(trophoblast cells)具有高分裂增殖能力、高侵襲性等惡性腫瘤細(xì)胞的顯著特征。然而與惡性腫瘤相反,該細(xì)胞的上述特征具有高度時空限制性——胚胎一旦成功植入母體子宮,滋養(yǎng)層細(xì)胞便停止侵襲、增殖。鑒于此,很多研究試圖通過利用滋養(yǎng)層細(xì)胞功能及調(diào)控機(jī)制的研究以期尋找腫瘤治療的新途徑。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、免疫細(xì)胞等細(xì)胞組分；以及多種抑制性細(xì)胞因子、趨化因子、信號分子、胞外基質(zhì)等非細(xì)胞組分共同構(gòu)成。其中免疫細(xì)胞群體包含：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)、髓源抑制性細(xì)胞(MDSC)、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(TAN)、腫瘤相關(guān)Th17細(xì)胞、調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞(DCreg)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等。腫瘤細(xì)胞與募集至此的宿主免疫細(xì)胞發(fā)生交互對話(crosstalk),使得原本具有攻擊性的免疫細(xì)胞發(fā)生誘導(dǎo)再馴化(reeducation),從而有利于腫瘤微環(huán)境中免疫耐受的建立。研究證實(shí),作為腫瘤微環(huán)境中數(shù)目最大的免疫細(xì)胞群體,TAM在某些腫瘤中所占比例可高達(dá)50%。該細(xì)胞具有M2巨噬細(xì)胞(Alternatively activated macrophages)特征,能夠優(yōu)勢產(chǎn)生包括TGF-β, IL-4, IL-10以及PGE2在內(nèi)的多種抗炎細(xì)胞因子,在腫瘤組織中的浸潤數(shù)目及其位置與腫瘤的預(yù)后呈密切相關(guān)。提示：TAM在腫瘤免疫及腫瘤微環(huán)境的建立及維持方面具有重要作用。此外,單核系髓源抑制細(xì)胞亞群(Mo-MDSC)是新近發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于患者腫瘤組織中的免疫抑制細(xì)胞。該細(xì)胞一方面通過釋放VEGF、bFGF以及MMPs促進(jìn)腫瘤血管形成,另一方面通過高表達(dá)ARG-1、COX2、IDO1、IL-4Rα等免疫抑制分子抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。已證實(shí),作為維持腫瘤免疫耐受微環(huán)境主力的TAM與Mo-MDSC均由髓源單核細(xì)胞(myelomonocytic cells)分化產(chǎn)生。提示,腫瘤組織中異常增多的TAM與Mo-MDSC可能是由腫瘤微環(huán)境募集髓源單核細(xì)胞并加以誘導(dǎo)分化產(chǎn)生的結(jié)果。然而,腫瘤微環(huán)境對其進(jìn)行誘導(dǎo)分化的具體途徑目前仍然知之甚少。腫瘤微環(huán)境中存在的多種促免疫抑制作用細(xì)胞因子、趨化因子及信號分子,對于募集馴化免疫細(xì)胞、活化內(nèi)皮細(xì)胞生成血管、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及粘附均發(fā)揮重要作用。其中,趨化因子配體2(chemokine(C-Cmotif)ligand2,CCL2),在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、直腸癌等腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)有異常升高。CCL2作為趨化因子配體首先被證實(shí)通過與其受體CCR2結(jié)合的方式對髓源單核細(xì)胞及其分化產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞等發(fā)揮高效募集遷移作用。研究表明,CCL2在腫瘤組織中的表達(dá)水平與腫瘤大小、是否發(fā)生轉(zhuǎn)移等預(yù)后指標(biāo)密切相關(guān)。此外,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CCL2能夠通過抑制產(chǎn)生Th1型促炎性細(xì)胞因子來維持口腔免疫耐受微環(huán)境；誘導(dǎo)T細(xì)胞極化為具有抗炎功能的Th2型細(xì)胞；上調(diào)并活化髓源單核細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子-3(STAT-3)——該分子的上調(diào)及活化被認(rèn)為是Mo-MDSC擴(kuò)增及活化的必要信號。提示：腫瘤微環(huán)境中存在異常增高的CCL2可能在對髓源單核細(xì)胞的募集、誘導(dǎo)、分化過程中發(fā)揮重要作用。腫瘤細(xì)胞的分裂增殖、侵襲、遷移、以及腫瘤微環(huán)境對免疫細(xì)胞誘導(dǎo)再馴化過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的重大改變均涉及到細(xì)胞骨架的重排。驅(qū)動蛋白超家族(Kinesin superfamily, Kif)是一類微管依賴的分子馬達(dá)蛋白,參與細(xì)胞的骨架重排、有絲分裂以及物質(zhì)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)等細(xì)胞進(jìn)程。研究證實(shí),該超家族成員之一Kif4A不但是多細(xì)胞進(jìn)程的必須因子,還是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要觸發(fā)器。通過對肺癌以及舌鱗狀細(xì)胞癌研究發(fā)現(xiàn),Kif4A的表達(dá)水平與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)——該分子表達(dá)水平越高,患者瘤體越大,治療后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的概率越大。值得注意的是,有報(bào)道證實(shí),Kif4A參與T細(xì)胞的活化過程。提示,該蛋白對諸如T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的誘導(dǎo)分化具有潛在調(diào)控作用。結(jié)合已有研究,本課題將從腫瘤微環(huán)境中存在高水平的CCL2這一現(xiàn)象入手,通過體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)探討該趨化因子在髓源單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有高度免疫抑制功能的Mo-MDSC以及優(yōu)勢表達(dá)抗炎細(xì)胞因子的M2樣巨噬細(xì)胞過程中的作用及其相關(guān)機(jī)制。并對Kif4A是否參與CCL2對髓源單核細(xì)胞的該誘導(dǎo)分化過程加以驗(yàn)證,以期進(jìn)一步補(bǔ)充CCL2在建立及維持免疫耐受微環(huán)境過程中作用及機(jī)制。第一部分CCL2及Kif4A對巨噬細(xì)胞募集及分化的影響目的：建立體外共培養(yǎng)體系,部分模擬腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互作用,探討CCL2及Kif4A在此過程中對巨噬細(xì)胞募集及分化的影響。方法：1.建立腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系以舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Cal-27以及人單核細(xì)胞系THP-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的M0型巨噬細(xì)胞為工具,利用0.4|xm Transwell建立間接共培養(yǎng)體系。2.檢測共培養(yǎng)體系中Kif4A以及CCL2/CCR2的改變利用Western blotting檢測共培養(yǎng)體系中各類細(xì)胞Kif4A、CCR2表達(dá)水平,ELISA檢測上清中CCL2水平變化,RTQ-PCR角定CCL2的細(xì)胞來源。3.阻斷共培養(yǎng)體系中各類細(xì)胞Kif4A的表達(dá)、中和共培養(yǎng)體系CCL2利用siRNA技術(shù)分別將共培養(yǎng)體系中不同細(xì)胞組分Kif4A沉默,同時設(shè)scrRNA對照處理組,Western blotting;檢測感染效率。利用中和抗體消除共培養(yǎng)體系中CCL2的作用,同時設(shè)同型對照抗體處理組。4.檢測腫瘤細(xì)胞對巨噬細(xì)胞募集能力利用8 μm Transwell檢測阻斷Kif4A或中和CCL2, Cal-27細(xì)胞對巨噬細(xì)胞募集能力的改變。5.促炎/抗炎細(xì)胞因子及免疫抑制分子表達(dá)水平比較RTQ-PCR檢測不同處理?xiàng)l件下共培養(yǎng)體系中巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子TNF-α、 IL-1β、IL-6、IL-12p40;抗炎細(xì)胞因子TGF-β、IL-4、IL-10;免疫抑制分子ARG-1、COX2、IDO1、IL-4Rα、NOS2表達(dá)的改變。結(jié)果：1.Cal-27誘導(dǎo)THP-1來源巨噬細(xì)胞Kif4A及CCR2表達(dá)的上調(diào)Western Blotting檢測發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)體系中THP-1來源巨噬細(xì)胞Kif4A以及CCR2的表達(dá)較單獨(dú)培養(yǎng)時顯著上調(diào)(p0.01)。Cal-27細(xì)胞高表達(dá)Kif4A,而共培養(yǎng)體系對其無顯著影響。2.阻斷Kif4A,能夠顯著抑制共培養(yǎng)體系上調(diào)的CCL2水平ELISA及RTQ-PCR檢測證實(shí),共培養(yǎng)能夠顯著上調(diào)Cal-27細(xì)胞以及THP-1來源巨噬細(xì)胞CCL2表達(dá)及分泌水平(p0.01)；利用siRNA阻斷共培養(yǎng)細(xì)胞Kif4A,能夠顯著抑制CCL2的表達(dá)(p0.01)。3.Cal-27對THP-1來源的巨噬細(xì)胞的募集能力受Kif4A-CCL2調(diào)控遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí),共培養(yǎng)體系中Ca-127對THP-1來源的巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的募集能力。阻斷Cal-27或巨噬細(xì)胞的Kif4A,中和共培養(yǎng)體系中的CCL2,該募集能力均受到顯著削弱(p0.01)。4. Kif4A-CCL2介導(dǎo)共培養(yǎng)體系THP-1來源的巨噬細(xì)胞功能改變RTQ-PCR結(jié)果顯示阻斷共培養(yǎng)體系Kif4A表達(dá)或中和CCL2能顯著抑制巨噬細(xì)胞抗炎型細(xì)胞因子表達(dá)；促進(jìn)促炎型細(xì)胞因子表達(dá)。此外,共培養(yǎng)能后顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞免疫抑制分子ARG-1、COX2、IDO1、IL-4Rα表達(dá),阻斷共培養(yǎng)體系Kif4A表達(dá)或中和CCL2同樣能后抑制共培養(yǎng)體系對巨噬細(xì)胞免疫抑制分子表達(dá)的促進(jìn)作用。小結(jié)：腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞交互對話導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中CCL2顯著增高。CCL2在腫瘤細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的募集及M2誘導(dǎo)分化方面發(fā)揮重要作用,而Kif4A對該過程具有調(diào)控功能。該發(fā)現(xiàn)揭示了腫瘤微環(huán)境中高水平的CCL2是大量巨噬細(xì)胞募集至此并分化為優(yōu)勢表達(dá)抗炎細(xì)胞因子的M2型巨噬細(xì)胞的潛在誘因。而Kif4A對CCL2的正向調(diào)控作用提示其可能成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)。本部分創(chuàng)新點(diǎn)：本研究首次發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Kif4A的表達(dá)上調(diào)：上調(diào)的Kif4A能夠誘導(dǎo)CCL2以及CCR2表達(dá)顯著增高,進(jìn)而有利于腫瘤細(xì)胞對其的募集遷移作用；Kif4A-CCL2-CCR2途徑能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為優(yōu)勢表達(dá)抗炎細(xì)胞因子的M2樣巨噬細(xì)胞,并使其具有部分Mo-MDSC特征。第二部分CCL2調(diào)控髓源單核細(xì)胞分化為MDSCsi機(jī)制研究目的：探討CCL2在CD14+髓源單核細(xì)胞分化為Mo-MDSCs過程中的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步揭示CCL2在建立免疫耐受微環(huán)境中的作用機(jī)制。方法：1.檢測妊娠早期人外周中Mo-MDSCs比例流式細(xì)胞術(shù)分別檢測適齡未孕、早孕女性外周Mo-MDSCs (CD14+ HLA-DR-/low)所占CD14+髓源單核細(xì)胞比例。2.分選獲取髓源單核細(xì)胞以及CD4+T細(xì)胞利用密度低度離心法分離獲取健康適齡女性志愿者外周血單個核細(xì)胞(PBMC),采用CD14磁珠陽性分選獲取CD14+髓源單核細(xì)胞,采用CD4磁珠陽性分選獲取CD4+T細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞純度。3.建立體外共培養(yǎng)體系將胚胎來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR8/SVneo與分選獲得的髓源單核細(xì)胞按1：1比例進(jìn)行直接共培養(yǎng)40小時。4.檢測共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子表達(dá)的改變ELISA檢測共培養(yǎng)體系上清中CCL2, TGF-β,IL-4,IL-6,IL-8以及IL-10水平。同時設(shè)置兩種細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)對照組。5.分選共培養(yǎng)體系不同群體的髓源單核細(xì)胞利用流式分選技術(shù)將共培養(yǎng)體系中CD14+髓源單核細(xì)胞分離出來,然后將其進(jìn)一步分離為Mo-MDSCs (CD14+ HLA-DR-/low)及非Mo-MDSCs部分(CD14+HLA-DR+)6.T細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)將共培養(yǎng)體系經(jīng)流式分選獲得的CD14+髓源單核細(xì)胞、Mo-MDSCs、非Mo-MDSCs單核細(xì)胞分別按1：1比例與CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)3,5,7天。同時設(shè)置陽性對照組以及陰性對照組。7.免疫抑制分子的檢測RTQ-PCR檢測流式分選獲取的共培養(yǎng)體系CD14+髓源單核細(xì)胞、Mo-MDSCs、非Mo-MDSCs單核細(xì)胞ARG-1、COX2、IDO1、IL-4Rα以及NOS2表達(dá)的改變。8.CCL2中和實(shí)驗(yàn)抗體中和共培養(yǎng)體系中的CCL2,流式細(xì)胞術(shù)檢測Mo-MDSCs比例改變情況、該細(xì)胞抑制T細(xì)胞增殖能力的變化；RTQ-PCR檢測CD14+髓源單核細(xì)胞、Mo-MDSCs免疫抑制分子表達(dá)情況的改變。9. STAT3在共培養(yǎng)體系CD14+髓源單核細(xì)胞、Mo-MDSCs表達(dá)水平的檢測Western blotting檢測共培養(yǎng)體系中CD14+髓源單核細(xì)胞、Mo-MDSCs表達(dá)STAT3以及pSTAT3的水平。結(jié)果：1.妊娠早期Mo-MDSCs水平上升,滋養(yǎng)層細(xì)胞對其有顯著誘導(dǎo)作用妊娠早期女性外周血中Mo-MDSCs所占CD14+髓源單核細(xì)胞比例較之適齡未孕女性有顯著提高。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí),胚胎來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠顯著誘導(dǎo)CD14+髓源單核細(xì)胞分化為Mo-MDSCs(p0.01)。2.滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)的Mo-MDSCs能夠顯著抑制T細(xì)胞增殖共培養(yǎng)體系的Mo-MDSCs (CD14+HLA-DR-/low)較之單獨(dú)培養(yǎng)的CD14+髓源單核細(xì)胞以及共培養(yǎng)體系非Mo-MDSCs部分(CD14+ HLA-DR+)能夠顯著抑制T細(xì)胞增殖(p0.01)。3.滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠誘導(dǎo)CD14+髓源單核細(xì)胞CCL2表達(dá)及分泌的顯著上升ELISA及RTQ-PCR證明,滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠顯著誘導(dǎo)CD14+髓源單核細(xì)胞CCL2的表達(dá)及分泌(p0.01)；而對IL-4,IL-6,IL-8以及IL-10無顯著作用。4.CCL2對Mo-MDSCs誘導(dǎo)分化具有重要作用中和共培養(yǎng)體系中的CCL2能夠顯著下調(diào)Mo-MDSCs所占比例(p0.01),并使共培養(yǎng)體系CD14+髓源單核細(xì)胞對T細(xì)胞的抑制能力嚴(yán)重削弱。此外,該分子能夠顯著下調(diào)CD14+髓源單核細(xì)胞及Mo-MDSCs的免疫抑制分子Arg-1的表達(dá)(p0.01)。5.CCL2對Mo-MDSCs的誘導(dǎo)作用與STAT3的活性密切相關(guān)Western blotting檢測表明,共培養(yǎng)顯著上調(diào)CD14+髓源單核細(xì)胞(p)STAT-3的表達(dá),而中和CCL2能夠顯著降低其STAT-3水平。小結(jié)：與腫瘤細(xì)胞具有高度相似性的妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠誘導(dǎo)CD14+髓源單核細(xì)胞分泌大量的CCL2；而高水平的CCL2能通過活化STAT-3信號而促進(jìn)CD14+髓源單核細(xì)胞分化為Mo-MDSCs。該研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了CCL2在髓源單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化方面發(fā)揮的重要作用,這也為基于該分子的抗腫瘤免疫治療提供新的思路。本部分創(chuàng)新點(diǎn)：本研究通過體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)滋養(yǎng)層細(xì)胞能夠誘導(dǎo)CD14+髓源單核細(xì)胞分化為CD14+HLA-DR/low Mo-MDSC;通過中和抗體方法證實(shí),滋養(yǎng)層細(xì)胞對Mo-MDSC的誘導(dǎo)作用有賴于CCL2介導(dǎo)活化的STAT-3信號通路。通過本研究我們證實(shí),腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞交互對話是導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中CCL2顯著增高的重要原因。該趨化因子在腫瘤細(xì)胞對巨噬細(xì)胞的募集及M2誘導(dǎo)分化方面具有重要調(diào)控作用,而分子馬達(dá)蛋白Kif4A參與并介導(dǎo)此過程。此外,CCL2能夠通過活化STAT-3信號通路誘導(dǎo)具有高度可塑性的CD14+髓源單核細(xì)胞分化為高效免疫抑制細(xì)胞MDSC,并上調(diào)該細(xì)胞群體的免疫抑制分子表達(dá)。上述發(fā)現(xiàn)首次將腫瘤及妊娠微環(huán)境中高水平的CCL2與顯著增多的MDSC密切聯(lián)系起來；揭示腫瘤微環(huán)境中高水平的CCL2是大量巨噬細(xì)胞募集至此并分化為優(yōu)勢表達(dá)抗炎細(xì)胞因子的M2型巨噬細(xì)胞以及MDSC的潛在誘因；而Kif4A對CCL2的正向調(diào)控作用提示其可能成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)。這為旨在打破免疫耐受微環(huán)境的新腫瘤治療策略的制定以及腫瘤患者預(yù)后分析提供了可行的依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
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本文編號：1561530