本文選題：Fbw7　切入點：膠質瘤　出處：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：膠質瘤是中樞神經系統(tǒng)原發(fā)腫瘤中惡性程度最高的腫瘤之一,現有最有效的綜合治療方案為最大程度的手術切除加上術后的放療和烷化劑化療,卻因腫瘤的侵襲性和對放化療的抵抗而最終復發(fā),膠質母細胞瘤(GBM)的中位生存期僅14個月左右。以往的研究已揭示膠質瘤的惡性進展依賴于多個分子和信號通路形成的網絡,僅針對網絡中的某一靶點進行干預效果極為有限,因此尋求能夠調控多個與膠質瘤惡性進展相關的分子和信號通路的干預靶標,成為研究膠質瘤生物治療的前沿熱點。泛素蛋白酶系統(tǒng)(UPS)通過迅速降解蛋白質,來調節(jié)多種細胞生理過程,包括細胞增殖,生長,分化,凋亡衰老等。泛素酶系統(tǒng)包括泛素激活酶E1,形成并調節(jié)泛素分子鏈的泛素結合酶E2和直接與底物連接的泛素連接酶E3,E3連接酶直接決定泛素化調控的特異性,它主要包括APC(分裂后期促進復合物)和SCF(SKP1-CUL1-F-box復合物)這兩大類型,而Fbw7(F-box and WD repeat domain-containing 7)則是SCF型E3連接酶的底物結合單位,其調控異常在所有泛素體系中最為常見。Fbw7參與降解的底物包括一系列已知的促癌因子,其中有一大部分是參與細胞惡性轉化的轉錄因子和促癌信號通路上的蛋白分子,包括cyclin E,MYC,JUN,Notch等。Cyclin E與細胞周期激酶CDK2共同調節(jié)細胞從G1到S期的進程,對細胞增殖起到關鍵限速作用。作為細胞周期的重要調控因子,Cyclin E受到泛素蛋白酶系統(tǒng)的精確調控,其突變異常在腫瘤細胞中早已確認,過度激活的Cyclin E引起染色體基因組不穩(wěn)定從而引發(fā)腫瘤。c-Myc也是控制細胞周期的關鍵轉錄因子,在許多惡性腫瘤中發(fā)現具有拷貝數擴增,基因轉位等突變而導致表達水平升高,其轉錄活性參與調控細胞增殖、蛋白合成、凋亡、代謝以及細胞分化等生物過程;c-Jun是受絲裂原激活的API轉錄因子復合物的組份,在多種腫瘤細胞中呈組成性激活,發(fā)揮促進細胞增殖的效應;Notch是位于細胞膜的轉錄因子,其胞內區(qū)域被γ-分泌蛋白水解酶復合物切除成具有轉錄活性的成分,并進入細胞核發(fā)揮促進細胞分裂增殖以及抑制細胞成熟分化的作用。Fbw7因為對這些促癌分子的調控而成為最重要的抑癌基因。Fbw7在腫瘤中常見發(fā)生失活性突變,突變率從6%到35%不等,僅次于另外兩個抑癌基因p53和PTEN。此外Fbw7基因轉錄后的自身調控在腫瘤中也多見異常,p53,SREBP2,NF-k B1,Pin1,RITA,MEK-ERK,以及micro RNAs等分子和通路的異常激活,有的可以從轉錄水平上(如NF-κB1),有的從翻譯后磷酸化修飾層面(如ERK激酶)使得Fbw7的表達及活性下調,并最終導致其不能正常行使泛素連接酶的功能,從而致使正常生理情況下受到Fbw7泛素化調控的底物分子因降解受阻而逐漸在細胞中累積,或失去正常的隨細胞分化、生長等特定生理行為而改變的表達節(jié)律。以細胞增殖為例,正常細胞從G1期過渡到復制期S期時,周期蛋白Cyclin E的表達水平會出現生理性逐漸增加,并在S期起始點達到峰值,在細胞完成G1/S過渡后即在轉錄負調控以及Fbw7介導的泛素蛋白酶降解作用下,在細胞中的表達水平逐步下降,而與促進DNA合成相關酶轉錄激活有關的Cyclin A表達開始增加,顯而易見,當Fbw7的水平出現異常下調時,Cyclin E的功能持續(xù)激活,乃至不能受到細胞周期檢驗機制的約束,導致細胞周期蛋白的有序節(jié)律發(fā)生紊亂,DNA合成失常,形成單倍體、多倍體并引發(fā)惡性增殖。腫瘤的惡性生物行為還包括向周圍組織浸潤侵襲,乃至向遠隔組織轉移,以及腫瘤細胞的分化異常,比如腫瘤細胞出現表皮-間質轉化以及干性化。在這些通路上的分子均可能因為Fbw7的表達異常和功能喪失而失去正常調控,這是我們研究Fbw7參與膠質瘤惡性生物行為的理論基礎。就膠質瘤而言,臨床療效是我們更為關心的問題,由于膠質母細胞瘤的極高惡性程度,手術切除并不能從解剖上徹底根治腫瘤細胞,因此術后的同步放化療和輔助化療已成為膠質瘤綜合治療的金標準。替莫唑胺是二代烷化劑,是膠質瘤術后化療中應用最為廣泛的藥物,它可以導致腫瘤細胞的DNA斷裂,繼發(fā)凋亡、自噬抑或衰老,最終導致細胞死亡。遺憾的是并非所有膠質瘤患者都對替莫唑胺敏感,其中不少患者對其不敏感,或在治療過程中產生耐藥而使腫瘤迅速出現進展和復發(fā),顯然這是腫瘤細胞對化療藥物的抵抗和耐藥所致。我們課題組的前期研究已發(fā)現很多參與腫瘤細胞增殖、侵襲、凋亡機理的分子也同時參與了腫瘤細胞對化療藥物敏感性的調控,其中包括細胞膜藥物轉運蛋白的改變、凋亡和自噬的調控,DNA損傷的修復等機理的研究。上述這些與膠質瘤化療耐藥相關的機理中也存在大量Fbw7調節(jié)的靶點分子。這是我們研究Fbw7參與膠質瘤對化療藥敏感性改變的理論基礎。有關Fbw7對膠質瘤細胞的生物作用以及在腫瘤對替莫唑胺敏感性中的調控機理尚缺乏全面深入的研究,因此本課題旨在研究FBW7對膠質瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等生物行為的作用,腫瘤細胞對替莫唑胺敏感性的影響,并初步探討其機理。課題共分四大部分,第一部分通過數據庫查詢和石蠟標本免疫組化染色,觀察Fbw7在膠質瘤臨床樣本的表達,與病理級別及與患者預后的的關系;第二部分,構建Fbw7慢病毒過表達載體,在膠質瘤U251和U373細胞株中研究過表達Fbw7后對細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響;第三部分,在替莫唑胺誘導的U251耐藥株中檢測Fbw7的表達改變,過表達Fbw7后耐藥細胞對TMZ敏感性的影響,并觀察體外過表達Fbw7聯合TMZ治療對膠質瘤細胞生長的影響;第四部分,研究Fbw7對細胞周期和凋亡的改變作用以及對下游底物Auroa B、Mcl-1及Notch1的調控作用,從而探討其影響調控膠質瘤增殖、侵襲、遷移和對替莫唑胺敏感性的機制。第一部分Fbw7在膠質瘤臨床樣本中的表達與臨床相關性研究目的:研究Fbw7在不同級別腦膠質瘤組織中m RNA及蛋白表達,分析Fbw7的表達水平與膠質瘤患者預后的關系。方法:查詢TCGA數據庫中基于基因芯片檢測的m RNA信息和樣本對應的病人生存期資料,比較Fbw7在高低級別膠質瘤中的m RNA水平,利用KM生存分析法和log-rank檢驗比較Fbw7表達水平和病人預后的關系,應用免疫組織化學染色檢測Fbw7在50例(II級15例,III級10例,IV級30例)膠質瘤中的蛋白表達及細胞定位,對染色強度進行定量化后,利用秩和檢驗分析不同級別膠質瘤Fbw7的表達水平差異以及與增值標志Ki-67蛋白表達的關系。結果:Fbw7的m RNA水平在高級別膠質瘤中有明顯下調,IV級膠質母細胞瘤與II級相比差異有統(tǒng)計學意義。m RNA水平按中位數上下分為低表達和高表達,生存分析顯示兩組表達水平的生存期長短有顯著差異(P0.05)。免疫組化示Fbw7蛋白表達主要分布在細胞核及細胞質,Fbw7染色水平隨著腫瘤級別升高表達明顯下降,且表達水平與Ki-67指數明顯相關。結論:Fbw7的m RNA水平和蛋白水平均隨膠質瘤病理級別的增高而下調;表達水平與患者的生存時間明顯相關,與腫瘤增殖標志物Ki-67顯著相關。第二部分Fbw7影響膠質瘤增殖、侵襲及遷移能力的體外研究目的:通過慢病毒載體靶向過表達Fbw7,研究Fbw7對膠質瘤U251和U373細胞增殖活力的影響,以及對細胞體外侵襲及遷移特性的影響。方法:構建Fbw7過表達慢病毒轉染體系,在U251和U373細胞中過表達Fbw7,在細胞生長的不同時間點(24,48,72,96,120h)進行四甲基偶氮唑藍比色法(MTT法)檢測細胞活力,繪制細胞時間-活力曲線,觀察比較Fbw7對U251、U373細胞增殖活性的影響;同時利用集落形成實驗觀察Fbw7影響細胞生長形成克隆的能力。利用Transwell實驗觀察Fbw7轉染后72小時,瘤細胞侵襲能力的改變。利用Wound healing劃痕實驗比較過表達Fbw7后18h及36h,細胞遷移能力受到的影響。結果:通過熒光定量和WB測定證實,成功構建Fbw7過表達慢病毒載體經MTT法檢測,轉染Fbw7慢病毒后細胞生長48小時開始,U251、U373細胞株的活性與空白及陰性轉染對照組相比,有顯著降低。培養(yǎng)3周后,轉染Fbw7后,U251和U373細胞較之對照組細胞克隆(20 cells)形成數量有明顯減少(P0.001)。Transwell實驗結果顯示,Fbw7慢病毒轉染后72小時,U251及U373細胞的侵襲能力明顯下降,且差異具有顯著的統(tǒng)計學意義。細胞遷移實驗中,我們在劃線后18h和36h對兩種細胞的遷移距離進行了測量,結果顯示Fbw7過表達組的細胞遷移速度在這兩個時間點上與空白及陰性對照相比均有明顯減慢(p0.001)。結論:過表達Fbw7對膠質瘤U251和U373細胞株的體外增殖和克隆形成能力有明顯抑制;并且可以明顯降低膠質瘤的侵襲及遷移特性。第三部分Fbw7影響膠質瘤細胞對替莫唑胺敏感性的體外研究目的:;分析Fbw7在替莫唑胺誘導U251耐藥株的表達水平和對其耐藥性的影響,以及過表達Fbw7對U251細胞TMZ敏感性的影響。方法:用TMZ濃度梯度遞增誘導建立膠質瘤U251細胞耐藥株,West Blot檢測耐藥株與其親本株中Fbw7的蛋白表達差別。利用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT法)測定轉染Fbw7前后U251耐藥株對TMZ的耐藥指數改變。最后采用MTT法研究Fbw7過表達與TMZ聯合作用對U251細胞體外生長抑制的影響。結果:WB測得Fbw7在U251/TMZ細胞株中的相對表達低于U251對照。慢病毒轉染Fbw7后,U251/TMZ細胞的IC50指數與U251親本細胞株相比明顯減低。體外活力抑制實驗中,Fbw7轉染+TMZ聯合作用在36小時和72小時,較單用TMZ、單獨Fbw7轉染以及空白對照組,抑制率均顯著降低。結論:U251耐藥株的耐藥性獲得可能與細胞在藥物誘導過程中自發(fā)下調Fbw7的表達水平有關;過表達Fbw7后U251/TMZ耐藥株的耐藥指數逆轉。此外,Fbw7過表達則可以在體外增加TMZ對U251細胞的抑制率。第四部分Fbw7影響膠質瘤細胞惡性生物行為的機制研究目的:對Fbw7具體影響膠質瘤細胞體外增殖活性,侵襲遷移能力的機制進行研究,同時初步探討Fbw7影響膠質瘤對替莫唑胺化療敏感性的可能機制。方法:通過流式細胞術,檢測轉染Fbw7后U251膠質瘤細胞株的周期改變和凋亡情況,比較TMZ與Fbw7轉染作用后72h,不同干預組的細胞周期和凋亡改變情況,以及相關周期、凋亡相關分子改變。Western Blot法分析比較在Fbw7過表達后24和72小時,以及不同干預方式作用細胞后72小時周期激酶Aurora B,以及凋亡分子Caspase 3、Mcl-1、轉錄因子Notch1的改變。結果:Fbw7轉染U251細胞后72小時,流式細胞結果顯示轉染組聯合TMZ治療組,較對照組,單獨Fbw7轉染組,單獨TMZ治療組具有顯著增加的G2/M期比率,以及顯著減少的異倍體細胞比率。同時流式細胞凋亡檢測顯示在U251細胞中,Fbw7慢病毒轉染聯合TMZ治療組的細胞凋亡率與對照組,單獨Fbw7轉染組,單獨TMZ治療組相比明顯增加,差異有統(tǒng)計意義。WB結果顯示,周期激酶Aurora B的表達在轉染Fbw7 24和72小時點均低于對照U251細胞,并且轉染組72小時點表達水平較24小時有進一步降低趨勢;與此同時,凋亡效應分子Caspase 3在Fbw7轉染細胞中的表達量高于對照,且72小時點含量略高于24小時點,而與此相反Fbw7過表達后抑凋亡分子Mcl-1表達水平且隨時間逐步降低;進一步對轉錄因子Notch1蛋白的檢測發(fā)現在Fbw7轉染細胞后24和72小時,測得Notch1表達水平較空白組顯著減少,且在24小時點的蛋白表達低于Aurora B和Mcl-1。在Fbw7轉染U251細胞并聯合TMZ作用后72小時,WB檢測Aurora B表達較空白組和單獨TMZ組下調,但單獨TMZ組較空白組無明顯改變;Caspase 3水平與流式凋亡結果一致,聯合作用組較TMZ和對照組增加,而聯合作用組Mcl-1表達則有明顯降低,且單獨TMZ組較空白組Mcl-1上調;Fbw7過表達聯合TMZ作用72小時同樣顯著下調Notch1水平。結論:過表達Fbw7在體外實驗中對膠質瘤細胞增殖、遷移侵襲能力的抑制以及對TMZ的增敏作用機制,可能是通過下調周期激酶Aurora B,凋亡抑制底物Mcl-1,轉錄因子Notch1,進而使G2/M阻滯細胞增加,異常分裂細胞減少以及促進瘤細胞凋亡。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1558252