本文選題：核糖體蛋白S5　切入點：肝細(xì)胞癌　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝臟最常見的惡性腫瘤之一。乙肝和丙肝病毒感染,黃曲霉素B1暴露和肝纖維化是肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的主要危險因素。目前手術(shù)切除、肝臟移植、放化療等是常用的治療手段,但是大部分肝癌患者術(shù)后仍會出現(xiàn)全身性轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),因而愈后情況并不樂觀。越來越多的研究報道,肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移與上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)密切相關(guān)。EMT是指上皮細(xì)胞丟失細(xì)胞極性變成可移動的間充質(zhì)細(xì)胞的過程。在各種刺激因子作用下,肝細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程可獲得對化療藥的抵抗、遷移侵襲能力增強(qiáng)和干性等特征。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorβ,TGFβ)作為一種多功能細(xì)胞因子,可激活細(xì)胞內(nèi)多條信號通路參與EMT過程,是一個最強(qiáng)的EMT誘導(dǎo)劑。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)或腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cells,TIC)是指腫瘤細(xì)胞中具有干細(xì)胞特征且能夠發(fā)展為異質(zhì)性腫瘤的一小部分細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞可通過自我更新和分化產(chǎn)生大量腫瘤細(xì)胞,具有放化療抵抗,同時在體內(nèi)具有很高的成瘤性。有研究表明,EMT與細(xì)胞獲得干細(xì)胞特征密切相關(guān)。例如,Twist、Snail高表達(dá)或TGFβ刺激可誘導(dǎo)人乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生EMT,獲得CD44high/CD24low乳腺癌干細(xì)胞。類似地,乳腺癌干細(xì)胞也可由CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)乳腺癌上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過程獲得。核糖體蛋白表達(dá)異常與多種腫瘤有關(guān)。核糖體蛋白S5(ribosomal protein S5,RPS5)參與構(gòu)成真核生物核糖體40S小亞基,主要與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)RPS5在肝癌中高表達(dá),在結(jié)腸癌中低表達(dá)。近年來發(fā)現(xiàn)RPS5還有核糖體外功能。例如,RPS5能抑制鼠紅白血病(murine erythroleukemia,MEL)細(xì)胞分化。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),RPS5能抑制肝星狀細(xì)胞活化和EMT進(jìn)程以及實驗性肝纖維化,這些作用與其降低AKT在Ser473和Thr308位點的磷酸化,以及降低下游蛋白分子GSK3β和P70S6K的磷酸化密切相關(guān)。此外,還發(fā)現(xiàn)RPS5是苦參堿衍生物MASM的靶點。MASM通過穩(wěn)定肝星狀細(xì)胞和實驗動物模型肝臟內(nèi)RPS5蛋白表達(dá),發(fā)揮抗肝纖維化作用。目前關(guān)于RPS5與肝癌細(xì)胞EMT過程和腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生之間的研究,國內(nèi)外均未見報道。研究目的本課題將探討RPS5與肝癌細(xì)胞EMT過程和腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)系。此外,鑒于RPS5作為MASM的靶蛋白,我們還將研究MASM對肝腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生的作用。通過以上研究,闡明RPS5與肝癌之間的關(guān)系,進(jìn)一步明確RPS5參與調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制,探討RPS5作為肝癌治療潛在新靶點的可能性。研究方法一、RPS5在肝癌細(xì)胞EMT中的作用1、RPS5在TGFβ1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中表達(dá)變化以TGFβ1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Huh7和HCCLM3 EMT為模型,觀察不同濃度的TGFβ1刺激Huh7和HCCLM3細(xì)胞不同時間后肝癌細(xì)胞的形態(tài)改變,并抽提細(xì)胞蛋白和總RNA。用Western blots和Real time PCR分別檢測EMT相關(guān)指標(biāo)(ZO-1、E-cadherin、N-cadherin和vimentin)及RPS5在蛋白和m RNA水平的表達(dá)變化。2、RPS5敲減對肝癌細(xì)胞EMT的影響(1)Huh7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染RPS5的三個小干擾序列和對照Control si RNA,72 h后抽提細(xì)胞蛋白和總RNA。Real time PCR和Western blots檢測三個小干擾序列的干擾效果,并考察RPS5敲減后對EMT標(biāo)志物E-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)的影響。(2)構(gòu)建表達(dá)shRPS5和對照sh NC載體,包裝成Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒。慢病毒感染Huh7細(xì)胞72 h后,細(xì)胞加或不加TGFβ1再處理48 h,抽提細(xì)胞RNA和蛋白。Real time PCR和Western blots檢測EMT相關(guān)指標(biāo)和RPS5的表達(dá)變化。部分實驗將Huh7細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上,感染Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒。用免疫細(xì)胞熒光方法檢測細(xì)胞中EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)水平的變化。3、RPS5表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)EMT的作用機(jī)制研究Huh7細(xì)胞用2.5 ng/ml TGFβ1刺激48 h和72 h后,或感染Lenti-shRPS5和Lenti-sh NC 72 h后,加或不加TGFβ1處理48 h,抽提細(xì)胞蛋白。Western blots檢測PI3K/AKT/GSK3β,ERK和Smad2通路蛋白。4、RPS5過表達(dá)對RPS5 shRNA促進(jìn)的EMT進(jìn)程的影響構(gòu)建過表達(dá)RPS5載體(該RPS5序列轉(zhuǎn)錄的RPS5m RNA不能被RPS5shRNA所識別,稱之為RPS5突變體RPS5-mutant)和對照GFP載體,包裝成Lenti-GFP和Lenti-RPS5-mutant慢病毒。Huh7細(xì)胞感染Lenti-sh NC和Lenti-shRPS5慢病毒24 h后,再感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5-mutant慢病毒。繼續(xù)培養(yǎng)96h后抽提細(xì)胞蛋白。Western blots檢測RPS5及EMT標(biāo)志物(E-cadherin和vimentin)蛋白,同時檢測EMT相關(guān)信號通路蛋白。5、RPS5過表達(dá)對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響構(gòu)建過表達(dá)RPS5載體(該RPS5基因序列與人源的RPS5基因序列一致),包裝Lenti-RPS5慢病毒和對照Lenti-GFP慢病毒。Huh7和HCCLM3用TGFβ1刺激不同時間,或感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒72 h后,Transwell遷移實驗評價肝癌細(xì)胞的遷移能力。二、RPS5在肝腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生中的作用1、RPS5過表達(dá)對肝腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生的影響(1)Huh7細(xì)胞感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒并用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Huh7-GFP和Huh7-RPS5。Western blots方法確證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中RPS5蛋白高表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測RPS5對Ep CAM+和CD133+細(xì)胞數(shù)目的影響。(2)Huh7-GFP和Huh7-RPS5細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于干細(xì)胞培養(yǎng)基中,7天后計數(shù)第1代球體細(xì)胞個數(shù)并拍照比較球體大小。將第1代球體細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7天后計數(shù)第2代球體細(xì)胞個數(shù)。(3)瞬時感染Lenti-GFP和Lenti-RPS5慢病毒5天的Huh7細(xì)胞或Huh7-GFP和Huh7-RPS5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞,抽提細(xì)胞RNA。Real time PCR方法檢測干性相關(guān)基因(Ep CAM,CD133,Sox2,Oct3/4)的表達(dá)。(4)不同濃度梯度的多柔比星(Doxorubicin,DOX)處理Huh7-GFP和Huh7-RPS5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞72 h后,CCK8方法檢測細(xì)胞增殖情況,評價細(xì)胞對DOX的敏感性。2、8個肝癌細(xì)胞系RPS5表達(dá)水平的比較培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞系LO2和8個人肝癌細(xì)胞系MHCC-97H、MHCC-97L、Hep3B、PLC/PRF/5、SMMC-7721、Hep G2、HCCLM3和Huh7,抽提細(xì)胞蛋白。Western blots檢測不同細(xì)胞株RPS5蛋白表達(dá)水平。3、比較不同RPS5表達(dá)水平的肝癌細(xì)胞系其腫瘤干細(xì)胞特征選擇RPS5相對高表達(dá)細(xì)胞LM3和相對低表達(dá)細(xì)胞Huh7進(jìn)行以下實驗:(1)流式細(xì)胞儀檢測LM3和Huh7細(xì)胞中Ep CAM+和CD133+細(xì)胞數(shù)目。(2)用干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)LM3和Huh7細(xì)胞7天后,拍照觀察球體細(xì)胞大小并計數(shù)球體細(xì)胞個數(shù)。(3)Real time PCR方法檢測LM3和Huh7細(xì)胞中干性相關(guān)基因(Ep CAM,CD133,Sox2,Oct3/4)表達(dá)。(4)用不同濃度梯度的DOX和5-氟尿嘧啶(5-FU)處理LM3和Huh7細(xì)胞72 h后,CCK8方法檢測細(xì)胞增殖情況。三、苦參堿衍生物MASM在肝腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生中的作用1、MASM體外對肝腫瘤干細(xì)胞的作用(1)MASM(0,2,10和20μM)處理Huh7和Hep3B球體細(xì)胞72 h后,流式細(xì)胞儀檢測球體細(xì)胞中Ep CAM+和CD133+細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)。Real time PCR檢測球體細(xì)胞中干性相關(guān)基因(CD133,Ep CAM,Sox2和Oct3/4)和肝細(xì)胞相關(guān)基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)表達(dá)變化。(2)用上述不同濃度的MASM處理Huh7和Hep3B球體細(xì)胞7天后,拍照觀察第1代球體細(xì)胞大小并計數(shù)球體個數(shù)。將各組第1代球體細(xì)胞在無藥條件下再培養(yǎng)7天后計數(shù)第2代球體個數(shù)。依此法,培養(yǎng)獲得第3代球體細(xì)胞并計數(shù)。2、MASM對體內(nèi)肝癌種植瘤的生長及肝腫瘤干細(xì)胞生成的影響將人的肝癌細(xì)胞Huh7接種于裸鼠皮下構(gòu)建異種移植瘤模型。細(xì)胞接種24h后給予藥物處理。藥物處理分組:(1)生理鹽水組;(2)MASM處理組(10 mg/kg,每天灌胃給藥);(3)DOX組(6 mg/kg,腹腔注射,每周一次);(4)DOX和MASM聯(lián)合給藥組。給藥處理21天。待皮下種植瘤長出后,測量并計算腫瘤體積大小。實驗結(jié)束后手術(shù)剝離皮下種植瘤拍照并稱重。取MASM處理組和生理鹽水組腫瘤組織,經(jīng)胰酶消化后獲得單細(xì)胞懸液,在干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察腫瘤干細(xì)胞成球能力的差異。Real time PCR檢測MASM處理組和生理鹽水組腫瘤組織中干性相關(guān)基因以及肝細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的差異。3、MASM作用機(jī)制研究(1)MASM(0,2,10和20μM)處理Hep3B和Huh7細(xì)胞72 h后,抽提細(xì)胞蛋白。Western blots檢測PI3K/AKT/m TOR/P70S6K和GSK3β/β-catenin信號通路蛋白。(2)用10μM的CHIR-99021(GSK3β特異性抑制劑)與10μM MASM單獨或聯(lián)合處理Hep3B和Huh7細(xì)胞72 h后,抽提細(xì)胞蛋白。Western blots檢測GSK3β/β-catenin信號通路蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果一、RPS5在肝癌細(xì)胞EMT中的作用(一)RPS5在TGFβ1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中表達(dá)下調(diào)TGFβ1處理Huh7細(xì)胞48 h或72 h后,細(xì)胞由典型的卵圓形上皮細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。Western blots和Real time PCR結(jié)果表明,TGFβ1處理后可顯著下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin,而上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin(p0.01),同時RPS5 m RNA和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(p0.01)。TGFβ1處理LM3細(xì)胞第5天開始LM3細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形間質(zhì)細(xì)胞形態(tài),同時上調(diào)vimentin m RNA和蛋白表達(dá)水平,下調(diào)E-cadherin和RPS5(p0.01)。提示RPS5在EMT中可能發(fā)揮重要的作用。(二)RPS5敲減促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT1、RPS5 si RNA促進(jìn)Huh7肝癌細(xì)胞發(fā)生EMTRPS5 si RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后,RPS5 si RNA3可顯著下調(diào)RPS5 m RNA和蛋白水平,同時減少E-cadherin表達(dá)(p0.05),而增加N-cadherin和vimentin表達(dá)(p0.01),表明單獨的RPS5表達(dá)下調(diào)即可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT。2、RPS5 shRNA慢病毒感染細(xì)胞敲減RPS5促進(jìn)EMT進(jìn)程與RPS5 si RNA作用相似,RPS5shRNA慢病毒感染細(xì)胞后可顯著減少RPS5m RNA和蛋白表達(dá)(p0.01),同時顯著下調(diào)E-cadherin m RNA和蛋白表達(dá)(p0.05),上調(diào)vimentin表達(dá)(p0.05)。免疫細(xì)胞熒光結(jié)果表明,RPS5敲減后的細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào),而vimentin表達(dá)明顯上調(diào)。并且RPS5的作用不依賴于TGFβ1。(三)RPS5表達(dá)下調(diào)誘導(dǎo)EMT的作用機(jī)制1、TGFβ1刺激誘導(dǎo)EMT過程激活的細(xì)胞信號通路TGFβ1處理Huh7細(xì)胞誘導(dǎo)EMT發(fā)生,激活了AKT,ERK和Smad2信號通路,顯著增加AKT,ERK和Smad2磷酸化水平。這與文獻(xiàn)報道結(jié)果是一致的。2、RPS5 shRNA慢病毒感染細(xì)胞敲減RPS5促進(jìn)EMT的作用機(jī)制RPS5敲減后激活了AKT,ERK和Smad2信號通路,增加了AKT,ERK和Smad2磷酸化水平。(四)RPS5過表達(dá)逆轉(zhuǎn)RPS5 shRNA促進(jìn)的EMT進(jìn)程和相關(guān)信號通路1、RPS5過表達(dá)逆轉(zhuǎn)RPS5 shRNA促進(jìn)的EMT進(jìn)程在RPS5敲減的細(xì)胞中感染Lenti-RPS5-mutant慢病毒后,RPS5表達(dá)水平顯著增加(p0.05),同時下調(diào)的E-cadherin表達(dá)和上調(diào)的vimentin表達(dá)被部分恢復(fù)。表明RPS5可抑制EMT過程。2、RPS5過表達(dá)逆轉(zhuǎn)RPS5 shRNA激活的AKT和ERK通路在RPS5敲減的細(xì)胞中感染RPS5過表達(dá)突變體慢病毒Lenti-RPS5-mutant后,可明顯降低RPS5敲減后升高的AKT(Ser473)及其下游m TOR(Ser2448)磷酸化水平以及ERK(Thr202/Tyr204)磷酸化水平,而對升高的Smad2(Ser465/467)磷酸化無顯著影響。提示RPS5通過抑制AKT和ERK通路阻止EMT進(jìn)程。(五)RPS5過表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞遷移能力Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,TGFβ1處理Huh7或LM3細(xì)胞后細(xì)胞遷移數(shù)明顯多于對照組。這與文獻(xiàn)報道結(jié)果是一致的。RPS5過表達(dá)細(xì)胞遷移數(shù)明顯少于對照組。表明RPS5過表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞遷移能力。這可能與RPS5抑制EMT過程有關(guān)。二、RPS5在肝腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生中的作用(一)RPS5過表達(dá)抑制肝腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生1、Huh7細(xì)胞RPS5過表達(dá)抑制肝腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的產(chǎn)生Western blots結(jié)果確證Huh7-RPS5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中RPS5明顯高表達(dá)。與對照Huh7-GFP細(xì)胞相比,RPS5過表達(dá)的Huh7細(xì)胞中CD133+干細(xì)胞的數(shù)目明顯減少(83.76%vs.70.90%,p0.05),而對Ep CAM+細(xì)胞數(shù)無顯著影響(98.77%vs.96.51%)。2、RPS5過表達(dá)抑制Huh7成球能力和自我更新能力細(xì)胞懸浮成球培養(yǎng)實驗顯示,Huh7-RPS5細(xì)胞系產(chǎn)生的球體個數(shù)顯著少于Huh7-GFP細(xì)胞系(99±8 vs.70±4個,p0.05),表明RPS5過表達(dá)抑制Huh7細(xì)胞成球能力。第二代球體細(xì)胞計數(shù)發(fā)現(xiàn),Huh7-RPS5細(xì)胞系的球體個數(shù)依然少于Huh7-GFP細(xì)胞系(50±2 vs.38±3個,p0.05)。表明RPS5過表達(dá)抑制Huh7細(xì)胞自我更新能力。3、Huh7細(xì)胞RPS5過表達(dá)抑制干性相關(guān)基因的表達(dá)Huh7細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染RPS5過表達(dá)慢病毒5天后可顯著降低干性相關(guān)基因Ep CAM,Sox2和Oct3/4 m RNA水平(p0.05),但對CD133無影響。RPS5穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Huh7-RPS5中Ep CAM和CD133在m RNA水平的表達(dá)顯著下降(p0.05),而Sox2和Oct3/4表達(dá)無明顯變化。4、RPS5過表達(dá)對DOX的耐藥性降低耐藥性實驗結(jié)果表明,RPS5過表達(dá)可略微增加Huh7細(xì)胞對DOX的敏感性。DOX對Huh7-GFP細(xì)胞的IC50值為0.34μM,而對Huh7-RPS5細(xì)胞的IC50值為0.23μM。(二)8個肝癌細(xì)胞系RPS5表達(dá)水平的比較Western blots結(jié)果表明,LM3,PLC/PRF/5和Hep G2細(xì)胞中RPS5表達(dá)水平相對較高,而Huh7,SMMC-7721,Hep3B,MHCC-97H和MHCC-97L細(xì)胞中RPS5表達(dá)水平相對較低,與正常肝細(xì)胞系LO2表達(dá)水平相當(dāng)。(三)比較不同RPS5表達(dá)水平的肝癌細(xì)胞系的腫瘤干細(xì)胞特征1、Ep CAM+/CD133+肝腫瘤干細(xì)胞數(shù)比較流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明,RPS5相對高表達(dá)LM3細(xì)胞中CD133+細(xì)胞數(shù)明顯少于Huh7細(xì)胞(7.33%vs.81.11%,p0.01),而Ep CAM+細(xì)胞數(shù)兩者無顯著差異(89.46%vs.96.26%)。2、肝癌細(xì)胞成球能力的比較RPS5相對高表達(dá)LM3細(xì)胞球體個數(shù)明顯少于RPS5相對低表達(dá)Huh7細(xì)胞個數(shù)(62±2個和104±4個,p0.05)。3、干性相關(guān)基因表達(dá)水平的比較Real time PCR結(jié)果表明,RPS5相對高表達(dá)LM3細(xì)胞中Ep CAM和CD133在m RNA水平表達(dá)顯著低于RPS5相對低表達(dá)Huh7細(xì)胞(p0.01),而Sox2和Oct3/4表達(dá)水平無顯著差異。4、耐藥性比較RPS5相對高表達(dá)細(xì)胞株LM3對DOX的敏感性較RPS5低表達(dá)Huh7細(xì)胞高(IC50值:0.12μM vs.0.90μM,p0.05);LM3對5-FU的敏感性較Huh7相對較高(IC50值:76.5μM vs.454.5μM,p0.05)。三、苦參堿衍生物MASM抑制肝腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生(一)MASM體外抑制肝腫瘤干細(xì)胞1、MASM減少球體細(xì)胞Ep CAM+/CD133+細(xì)胞數(shù)目流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,MASM(10μM和20μM)處理Hep3B和Huh7球體細(xì)胞72 h可顯著減少兩種球體細(xì)胞Ep CAM+/CD133+的細(xì)胞數(shù)目,Hep3B球體細(xì)胞中Ep CAM+/CD133+的細(xì)胞數(shù)目由對照組的97.0%分別降低為86.5%和76.5%,Huh7球體細(xì)胞中Ep CAM+/CD133+的細(xì)胞數(shù)目由對照組的94.1%分別降低為82.1%和73.4%。2、MASM對球體細(xì)胞凋亡的影響MASM(10μM和20μM)處理Hep3B和Huh7球體細(xì)胞72 h可以不同程度的誘導(dǎo)球體細(xì)胞的凋亡,Hep3B球體細(xì)胞的凋亡率由對照組15.4%增加到21.1%和27.4%,Huh7球體細(xì)胞的凋亡率由對照組10.4%增加到13.5%和17.8%。3、MASM抑制肝癌球體細(xì)胞生長和自我更新(1)MASM(10μM和20μM)與Hep3B和Huh7球體細(xì)胞共孵育7天可以顯著減少第1代球體細(xì)胞數(shù)目和球體大小,表明MASM能抑制肝癌球體細(xì)胞的生長。(2)將第1代球體細(xì)胞消化后在無藥情況下,繼續(xù)培養(yǎng)第2代和第3代球體細(xì)胞。結(jié)果顯示藥物處理組球體細(xì)胞個數(shù)依然少于對照組,提示MASM抑制肝癌球體細(xì)胞的自我更新。4、MASM誘導(dǎo)肝腫瘤干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化MASM處理Hep3B和Huh7球體細(xì)胞72 h,可濃度依賴性地降低干性相關(guān)基因(Ep CAM,CD133,Sox2和Oct3/4)的表達(dá)水平(p0.05),而顯著增加肝細(xì)胞相關(guān)基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)的表達(dá)水平(p0.05),提示MASM誘導(dǎo)肝腫瘤干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。(二)MASM抑制體內(nèi)肝癌細(xì)胞異種移植瘤的生長及肝癌干細(xì)胞生成1、MASM抑制體內(nèi)肝癌種植瘤的生長體內(nèi)實驗結(jié)果表明,MASM(10 mg/kg)連續(xù)灌胃給藥21天可以顯著抑制Huh7細(xì)胞異種移植瘤的生長。MASM對腫瘤生長的抑制作用與DOX作用相當(dāng),二者合用后效果更佳。實驗結(jié)束后剝離腫瘤拍照并稱重,瘤塊大小和重量的結(jié)果與前述的腫瘤生長曲線結(jié)果一致。表明MASM可以抑制體內(nèi)異種移植瘤的生長。2、MASM抑制體內(nèi)肝腫瘤干細(xì)胞成球能力瘤塊組織消化分散為單細(xì)胞,再用干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)7天,結(jié)果顯示MASM處理組的球體個數(shù)顯著少于對照組的球體個數(shù)(26±5 vs.75±7,p0.05)。這與體外結(jié)果是一致的。3、MASM促進(jìn)瘤塊組織中腫瘤干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化Real time PCR結(jié)果表明,MASM處理組瘤塊組織中干性相關(guān)基因(Ep CAM,CD133,Sox2和Oct3/4)的表達(dá)水平顯著低于對照組(p0.05),而肝細(xì)胞相關(guān)基因(ALB,CYP1A3和G-6-P)的表達(dá)水平顯著高于對照組(p0.05)。這與體外結(jié)果是一致的。(三)MASM抑制腫瘤干細(xì)胞的分子機(jī)制1、MASM抑制PI3K/AKT信號通路不同濃度的MASM處理Huh7和Hep3B 72 h后,Western blots結(jié)果表明,MASM可以劑量依賴性的抑制PI3K/AKT相關(guān)信號通路蛋白的表達(dá),降低PI3K,AKT,m TOR和P70S6K磷酸化水平。2、MASM抑制β-catenin信號通路由于GSK3β是AKT的下游分子,而且GSK3β可以磷酸化β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)導(dǎo)致其進(jìn)一步的降解,但GSK3β不能磷酸化β-catenin(Ser675)。因此,我們檢測MASM對GSK3β和β-catenin磷酸化的影響以及β-catenin及其下游蛋白Cyclin D1的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MASM處理Huh7和Hep3B 72h后,可以顯著降低GSK3β(Ser9)磷酸化水平,同時促進(jìn)β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化,但對β-catenin(Ser675)磷酸化無影響。并且MASM下調(diào)β-catenin和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步應(yīng)用GSK3β特異性抑制劑CHIR驗證MASM是否特異地抑制β-catenin信號通路。結(jié)果顯示:與MASM作用相反,GSK3β特異性抑制劑CHIR可增加GSK3β(Ser9)磷酸化水平,抑制β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化而不影響β-catenin(Ser675)磷酸化,并且上調(diào)β-catenin蛋白水平。與MASM單獨作用相比,MASM與CHIR合用時,β-catenin(Ser33/Ser37/Thr41)磷酸化水平則較低,伴隨較高的β-catenin蛋白水平。這些結(jié)果提示MASM降低肝癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin水平可能是通過激活GSK3β,因為GSK3β(Ser9)磷酸化會導(dǎo)致其活性抑制,進(jìn)而穩(wěn)定β-catenin。結(jié)論1、TGFβ1刺激肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程中,伴隨RPS5表達(dá)下調(diào)。2、RPS5表達(dá)水平降低可促進(jìn)肝癌細(xì)胞EMT,其作用機(jī)制是通過激活A(yù)KT和 ERK通路。3、RPS5過表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞遷移和肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞產(chǎn)生。4、MASM抗肝癌作用與其抑制肝癌干細(xì)胞的自我更新及誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞分化 有關(guān),這些作用可能是通過抑制肝癌細(xì)胞PI3K/AKT/m TOR通路和 GSK3β/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1558153