發(fā)布時間：2018-03-02 00:20

  本文關(guān)鍵詞： SAMHD1 結(jié)腸癌 dNTPs 酶活性 LINE-1　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：SAMHD1是真核生物基因編碼的一種蛋白質(zhì)。它是一種天然的抗病毒因子,具有d NTPase活性,能夠降低細胞內(nèi)的d NTPs水平,從而能夠抑制病毒的復(fù)制。并且SAMHD1在生物體內(nèi)含量豐富,在人體內(nèi)的很多組織中均有表達,是一種豐富度較高的蛋白。SAMHD1不僅能夠抑制病毒的復(fù)制,而且在很多腫瘤細胞中表達的SAMHD1也會消耗細胞內(nèi)的d NTPs,從而起到抑制腫瘤細胞增殖的作用。但在腫瘤細胞中,SAMHD1通常會發(fā)生突變,這一突變將會影響它的活性,進而影響它的抗腫瘤作用,而且它的表達量也會有不同程度的降低。通過比較結(jié)腸癌中的五種單一位點突變體與野生型(109aa-626aa),我們發(fā)現(xiàn),發(fā)生突變的SAMHD1依然能夠在原核生物中表達,只是可溶性發(fā)生了不同程度的變化,雖然以包涵體形式表達的蛋白占大部分,但通過擴大培養(yǎng),仍然可以得到足夠量的可溶性蛋白用于純化和后續(xù)的結(jié)構(gòu)方面的研究。在一定條件下,在適量的純化后的SAMHD1及其突變體中加入底物d GTP后,反應(yīng)一段時間,通過高效液相色譜法測定SAMHD1及其突變體的活力,我們發(fā)現(xiàn),結(jié)腸癌中SAMHD1相關(guān)突變體其d NTPase活性大部分幾乎完全喪失,這極有可能是造成它不能抑制腫瘤細胞增殖的原因。相關(guān)報道表明,SAMHD1可以抑制逆轉(zhuǎn)錄元件LINE-1的轉(zhuǎn)座,而這一功能與腫瘤的發(fā)生也密切相關(guān)。通過在細胞中共轉(zhuǎn)染LINE-1及SAMHD1及其突變體質(zhì)粒,我們發(fā)現(xiàn),突變后的SAMHD1對LINE-1的抑制能力降低,這可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的一個因素。之前對SAMHD1的研究結(jié)果還表明,SAMHD1的抗病毒作用可以被HIV-2/SIV的附屬蛋白Vpx抑制,Vpx通過招募E3泛素復(fù)合物,使SAMHD1發(fā)生泛素化,從而被蛋白酶體降解。在SAMHD1及其相關(guān)結(jié)腸癌突變體的研究中,我們發(fā)現(xiàn)SAMHD1及其突變體在與Vpx互作方面,除了D497Y,和野生型一樣,依然可以被Vpx降解。這可能是由于D497Y距Vpx互作區(qū)比較近,其突變引發(fā)的構(gòu)象改變導(dǎo)致了其不能被Vpx降解。本文通過對結(jié)腸癌中的SAMHD1五種突變體進行研究,主要研究突變后的SAMHD1和野生型的SAMHD1相比在消耗細胞內(nèi)d NTPs的差異,也就是SAMHD1的酶活性的差異,以及被Vpx降解的差異及對逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE-1的影響。最終我們得到的一些數(shù)據(jù),對于SAMHD1及其相關(guān)疾病突變體的功能深入研究提供了一些參考。
[Abstract]:SAMHD1 is a protein encoded by eukaryotic genes. It is a natural antiviral factor with d NTPase activity, which can reduce the level of d NTPs in cells and thus inhibit the replication of virus. Expressed in many tissues of the human body, it is a rich protein. SAMHD1 can not only inhibit the replication of the virus, Moreover, SAMHD1 expressed in many tumor cells also consumes d NTPsin the cell, which inhibits the proliferation of tumor cells. But in tumor cells, SAMHD1 usually mutates, and this mutation will affect its activity. By comparing the five single-locus mutants in colon cancer with wild type 109aa-626a, we found that the mutated SAMHD1 could still be expressed in prokaryotes. But the solubility changed in different degrees, although the protein expressed in the form of inclusion body accounted for the majority, but through the expansion of culture, A sufficient amount of soluble protein can still be obtained for purification and subsequent structural studies. Under certain conditions, the substrates d GTP were added to the purified SAMHD1 and its mutants for a period of time. The activity of SAMHD1 and its mutants was determined by HPLC. We found that the d NTPase activity of SAMHD1 related mutants in colon cancer was almost completely lost. This is probably the reason why it can not inhibit the proliferation of tumor cells. It has been reported that SAMHD1 can inhibit the transposition of the reverse transcription element LINE-1. By co-transfection of LINE-1 and SAMHD1 and their mutant particles, we found that the inhibition of LINE-1 by mutated SAMHD1 was decreased. This may be a factor leading to tumorigenesis. Previous studies of SAMHD1 have also shown that the antiviral effect of SAMHD1 can be inhibited by Vpx, a subsidiary protein of HIV-2/SIV, which induces ubiquitin in SAMHD1 by recruiting the E3 ubiquitin complex. In the study of SAMHD1 and its associated colon cancer mutants, we found that SAMHD1 and its mutants interact with Vpx, except for D497Y, which is similar to the wild type. It is possible that D497Y can not be degraded by Vpx due to the conformational change caused by the conformation of D497Y, which is close to the interaction region between Vpx and D497Y. In this paper, we studied five SAMHD1 mutants in colon cancer. The difference of d NTPs in consuming cells between mutant SAMHD1 and wild type SAMHD1, that is, the difference of enzyme activity of SAMHD1, the difference of degradation by Vpx and the effect on retrotransposon LINE-1 were studied. Some references are provided for the further study of the function of SAMHD1 and its related disease mutants.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35

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本文編號：1554230