本文關(guān)鍵詞： 肺癌 轉(zhuǎn)移 hsv2-miR-H9-5p 靶基因 SOCS2　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,也是目前對人類生命健康威脅最大的惡性腫瘤之一。隨著我國工業(yè)化進程的發(fā)展、對環(huán)境的破壞以及北方地區(qū)日益嚴重的霧霾污染,肺癌已經(jīng)成為我國第一大腫瘤,2012年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示肺癌發(fā)病率和死亡率分列男性腫瘤首位,女性腫瘤發(fā)病率的第二位和死亡率的第一位,且肺癌病人五年生存率低,80%的肺癌患者臨床確診時已經(jīng)失去手術(shù)機會。肺癌易發(fā)生腦和骨的轉(zhuǎn)移,其中肺癌骨轉(zhuǎn)移是肺癌的主要并發(fā)癥,主要癥狀包括疼痛、病理性的骨折和椎體轉(zhuǎn)移的脊髓壓迫以及高血鈣和身體狀況的下降等。肺癌患者出現(xiàn)腦、骨轉(zhuǎn)移,會嚴重影響病人生存質(zhì)量,因此在肺癌發(fā)生和發(fā)展過程中尋找和篩選與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因子對于肺癌病人的預(yù)后和生活質(zhì)量密切相關(guān)。生物學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA分子是真核生物內(nèi)源性編碼的小RNA分子,主要參與了mRNA干擾現(xiàn)象,其作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在病毒、動物和植物等多物種的轉(zhuǎn)錄后mRNA沉默效應(yīng)(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前研究已經(jīng)證實miRNA主要通過其成熟體序列中的種子序列與靶基因mRNA結(jié)合,造成mRNA降解或者抑制靶基因蛋白翻譯進而瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控一個或多個基因的表達。目前對腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中相關(guān)miRNA的研究主要聚焦于人體內(nèi)源性miRNA,而越來越多的研究表明外源性的miRNA尤其是病毒來源的miRNA在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中也發(fā)揮著重要作用,病毒miRNA是病毒在感染人體過程中產(chǎn)生的具有RNA干擾效果的一類病毒來源的RNA分子。2004年在皰疹病毒家族中發(fā)現(xiàn)了首個病毒編碼的miRNA后,漸多的研究證實病毒編碼的miRNA能夠靶向其自身的病毒來源的mRNA以調(diào)節(jié)其在感染過程不同階段病毒蛋白的表達。近來有研究表明部分病毒來源的miRNA還可以通過靶向人體細胞內(nèi)源性的基因來重塑細胞內(nèi)環(huán)境,使其更適合感染需要,如已有報道Kaposi肉瘤相關(guān)的皰疹病毒KSHV可以利用病毒miRNA分子調(diào)節(jié)人體內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄。本課題主要通過芯片篩選出肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中差異表達的miRNA分子,選擇目的miRNA分子驗證差異表達后,圍繞病毒編碼的miRNA分子hsv2-miR-H9-5p及其人體細胞內(nèi)靶基因SOCS2在肺癌發(fā)生和發(fā)展過程中相互作用的分子機制和生物學(xué)功能開展初步和嘗試性研究。第一部分 肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的microrna篩選和差異表達驗證目的:使用mirna表達譜芯片以原發(fā)性肺癌組織樣本和肺癌骨轉(zhuǎn)移組織樣本對比篩查,篩選出肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的,在肺癌轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)異常表達的mirna分子。生物信息學(xué)分析結(jié)合文獻查閱尋找有研究意義的目的mirna。擴大檢測的樣本量驗證目的mirna存在差異性表達。方法:使用exiqon公司mirna表達譜芯片,以10例肺癌骨轉(zhuǎn)移組織標本和10例原發(fā)性肺癌組織對比篩查,得到在肺癌轉(zhuǎn)移過程中差異表達的mirna分子;使用實時熒光定量pcr實驗驗證目的mirna差異表達表達,并進一步擴大樣本量驗證芯片結(jié)果。結(jié)果:mirna分子肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中出現(xiàn)差異性表達。選擇hsv2-mir-h9-5p作為研究的目的mirna。實時熒光定量pcr驗證hsv2-mir-h9-5p差異性表達,進一步擴大樣本量驗證\其在原發(fā)性肺癌標本和肺癌骨轉(zhuǎn)移標本中存在差異表達。結(jié)論:在肺癌骨轉(zhuǎn)移過程中,mirna差異性表達表明其可能在肺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。hsv2-mir-h9-5p表達差異較大,采用熒光定量pcr實驗,驗證芯片結(jié)果并進一步擴大樣本量驗證其存在差異表達。芯片結(jié)果和熒光定量pcr結(jié)果表明hsv2-mir-h9-5p可能在肺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定的功能,可以作為下一步研究的目的mirna分子。第二部分 hsv2-mir-h9-5p及其靶基因在肺癌細胞中功能研究目的:使用肺癌細胞株ltep-α-2和spc-α-1在細胞水平證實hsv2-mir-h9-5p在肺癌轉(zhuǎn)移過程中具有生物學(xué)功能。探討hsv2-mir-h9-5p與靶基因的相互作用和可能的調(diào)控機制。研究hsv2-mir-h9-5p靶基因socs2的生物學(xué)功能。方法:transwell小室檢測hsv2-mir-h9-5p對肺癌細胞遷移能力的影響;transwell小室基質(zhì)膠侵襲實驗檢測其對肺癌細胞侵襲能力的影響;生物信息學(xué)分析(mirdb,rnahybrid,targetscan等)結(jié)合rna芯片確定hsv2-mir-h9-5p的靶基因,雙熒光素酶報告基因驗證靶基因并從mrna水平和蛋白質(zhì)水平確認靶基因表達水平的改變;研究靶基因SOCS2對肺癌細胞LTEP-α-2和SPC-α-1的生物學(xué)行為的影響。結(jié)果:遷移實驗結(jié)果表明hsv2-miR-H9-5p促進肺癌細胞遷移能力;基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果表明hsv2-miR-H9-5p促進肺癌細胞對基質(zhì)膠的侵襲能力;使用細胞增殖和活性檢測試劑盒CCK-8檢測發(fā)現(xiàn),相對于negative control,hsv2-miR-H9-5p mimic促進了肺癌細胞LTEP-α-2和SPC-α-1增殖能力;使用流式細胞儀進行的凋亡檢測發(fā)現(xiàn)hsv2-miR-H9-5p增強了肺癌細胞的抗凋亡能力;細胞周期分析未見明顯區(qū)別;雙熒光素酶報告基因驗證實驗表明SOCS2是hsv2-mi R-H9-5p靶基因之一,實時熒光定量PCR實驗和Western Blot實驗分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平進一步證實SOCS2為hsv2-miR-H9-5p靶基因;SOCS2生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)SOCS2在細胞水平削弱肺癌細胞的遷移和對基質(zhì)膠的侵襲能力,抑制肺癌細胞的增殖,促進肺癌細胞凋亡。結(jié)論:研究表明hsv2-miR-H9-5p能夠促進肺癌細胞的惡性表型,促進肺癌細胞的遷移和侵襲能力,靶基因SOCS2 mRNA 3’UTR區(qū)是外源性病毒來源的hsv2-miR-H9-5p的特異性調(diào)控位點,并且靶基因SOCS2在mRNA和蛋白質(zhì)層面表達水平受到hsv2-mi R-H9-5p的調(diào)控。蛋白質(zhì)編碼基因SOCS2的功能在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中已有研究,在不同腫瘤中其功能也有所不同,在本課題研究過程中使用的兩株肺癌細胞系LTEP-α-2和SPC-α-1中,發(fā)現(xiàn)其對肺癌細胞的的惡性生物學(xué)行為起到了抑制作用。我們的研究從細胞層面證實病毒感染人體之后可通過其自身編碼的miRNA分子從基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面對細胞內(nèi)源性基因進行調(diào)控提供了直接證據(jù),并且進一步加深了對在肺癌發(fā)生和進展過程中病毒及其編碼的miRNA分子調(diào)控的生物學(xué)機制的理解。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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