本文關(guān)鍵詞： 肺癌 轉(zhuǎn)移 hsv2-miR-H9-5p 靶基因 SOCS2　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一,也是目前對(duì)人類生命健康威脅最大的惡性腫瘤之一。隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的發(fā)展、對(duì)環(huán)境的破壞以及北方地區(qū)日益嚴(yán)重的霧霾污染,肺癌已經(jīng)成為我國(guó)第一大腫瘤,2012年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示肺癌發(fā)病率和死亡率分列男性腫瘤首位,女性腫瘤發(fā)病率的第二位和死亡率的第一位,且肺癌病人五年生存率低,80%的肺癌患者臨床確診時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)。肺癌易發(fā)生腦和骨的轉(zhuǎn)移,其中肺癌骨轉(zhuǎn)移是肺癌的主要并發(fā)癥,主要癥狀包括疼痛、病理性的骨折和椎體轉(zhuǎn)移的脊髓壓迫以及高血鈣和身體狀況的下降等。肺癌患者出現(xiàn)腦、骨轉(zhuǎn)移,會(huì)嚴(yán)重影響病人生存質(zhì)量,因此在肺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中尋找和篩選與肺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的因子對(duì)于肺癌病人的預(yù)后和生活質(zhì)量密切相關(guān)。生物學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA分子是真核生物內(nèi)源性編碼的小RNA分子,主要參與了mRNA干擾現(xiàn)象,其作為重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子在病毒、動(dòng)物和植物等多物種的轉(zhuǎn)錄后mRNA沉默效應(yīng)(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前研究已經(jīng)證實(shí)miRNA主要通過(guò)其成熟體序列中的種子序列與靶基因mRNA結(jié)合,造成mRNA降解或者抑制靶基因蛋白翻譯進(jìn)而瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)。目前對(duì)腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中相關(guān)miRNA的研究主要聚焦于人體內(nèi)源性miRNA,而越來(lái)越多的研究表明外源性的miRNA尤其是病毒來(lái)源的miRNA在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用,病毒miRNA是病毒在感染人體過(guò)程中產(chǎn)生的具有RNA干擾效果的一類病毒來(lái)源的RNA分子。2004年在皰疹病毒家族中發(fā)現(xiàn)了首個(gè)病毒編碼的miRNA后,漸多的研究證實(shí)病毒編碼的miRNA能夠靶向其自身的病毒來(lái)源的mRNA以調(diào)節(jié)其在感染過(guò)程不同階段病毒蛋白的表達(dá)。近來(lái)有研究表明部分病毒來(lái)源的miRNA還可以通過(guò)靶向人體細(xì)胞內(nèi)源性的基因來(lái)重塑細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,使其更適合感染需要,如已有報(bào)道Kaposi肉瘤相關(guān)的皰疹病毒KSHV可以利用病毒miRNA分子調(diào)節(jié)人體內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄。本課題主要通過(guò)芯片篩選出肺癌骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中差異表達(dá)的miRNA分子,選擇目的miRNA分子驗(yàn)證差異表達(dá)后,圍繞病毒編碼的miRNA分子hsv2-miR-H9-5p及其人體細(xì)胞內(nèi)靶基因SOCS2在肺癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中相互作用的分子機(jī)制和生物學(xué)功能開展初步和嘗試性研究。第一部分 肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的microrna篩選和差異表達(dá)驗(yàn)證目的:使用mirna表達(dá)譜芯片以原發(fā)性肺癌組織樣本和肺癌骨轉(zhuǎn)移組織樣本對(duì)比篩查,篩選出肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的,在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中出現(xiàn)異常表達(dá)的mirna分子。生物信息學(xué)分析結(jié)合文獻(xiàn)查閱尋找有研究意義的目的mirna。擴(kuò)大檢測(cè)的樣本量驗(yàn)證目的mirna存在差異性表達(dá)。方法:使用exiqon公司mirna表達(dá)譜芯片,以10例肺癌骨轉(zhuǎn)移組織標(biāo)本和10例原發(fā)性肺癌組織對(duì)比篩查,得到在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中差異表達(dá)的mirna分子;使用實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目的mirna差異表達(dá)表達(dá),并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證芯片結(jié)果。結(jié)果:mirna分子肺癌骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中出現(xiàn)差異性表達(dá)。選擇hsv2-mir-h9-5p作為研究的目的mirna。實(shí)時(shí)熒光定量pcr驗(yàn)證hsv2-mir-h9-5p差異性表達(dá),進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證\其在原發(fā)性肺癌標(biāo)本和肺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中存在差異表達(dá)。結(jié)論:在肺癌骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中,mirna差異性表達(dá)表明其可能在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。hsv2-mir-h9-5p表達(dá)差異較大,采用熒光定量pcr實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證芯片結(jié)果并進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證其存在差異表達(dá)。芯片結(jié)果和熒光定量pcr結(jié)果表明hsv2-mir-h9-5p可能在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮一定的功能,可以作為下一步研究的目的mirna分子。第二部分 hsv2-mir-h9-5p及其靶基因在肺癌細(xì)胞中功能研究目的:使用肺癌細(xì)胞株ltep-α-2和spc-α-1在細(xì)胞水平證實(shí)hsv2-mir-h9-5p在肺癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有生物學(xué)功能。探討hsv2-mir-h9-5p與靶基因的相互作用和可能的調(diào)控機(jī)制。研究hsv2-mir-h9-5p靶基因socs2的生物學(xué)功能。方法:transwell小室檢測(cè)hsv2-mir-h9-5p對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響;transwell小室基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響;生物信息學(xué)分析(mirdb,rnahybrid,targetscan等)結(jié)合rna芯片確定hsv2-mir-h9-5p的靶基因,雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證靶基因并從mrna水平和蛋白質(zhì)水平確認(rèn)靶基因表達(dá)水平的改變;研究靶基因SOCS2對(duì)肺癌細(xì)胞LTEP-α-2和SPC-α-1的生物學(xué)行為的影響。結(jié)果:遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hsv2-miR-H9-5p促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移能力;基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明hsv2-miR-H9-5p促進(jìn)肺癌細(xì)胞對(duì)基質(zhì)膠的侵襲能力;使用細(xì)胞增殖和活性檢測(cè)試劑盒CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn),相對(duì)于negative control,hsv2-miR-H9-5p mimic促進(jìn)了肺癌細(xì)胞LTEP-α-2和SPC-α-1增殖能力;使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行的凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hsv2-miR-H9-5p增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞的抗凋亡能力;細(xì)胞周期分析未見明顯區(qū)別;雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明SOCS2是hsv2-mi R-H9-5p靶基因之一,實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和Western Blot實(shí)驗(yàn)分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證實(shí)SOCS2為hsv2-miR-H9-5p靶基因;SOCS2生物學(xué)功能研究發(fā)現(xiàn)SOCS2在細(xì)胞水平削弱肺癌細(xì)胞的遷移和對(duì)基質(zhì)膠的侵襲能力,抑制肺癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。結(jié)論:研究表明hsv2-miR-H9-5p能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性表型,促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,靶基因SOCS2 mRNA 3’UTR區(qū)是外源性病毒來(lái)源的hsv2-miR-H9-5p的特異性調(diào)控位點(diǎn),并且靶基因SOCS2在mRNA和蛋白質(zhì)層面表達(dá)水平受到hsv2-mi R-H9-5p的調(diào)控。蛋白質(zhì)編碼基因SOCS2的功能在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中已有研究,在不同腫瘤中其功能也有所不同,在本課題研究過(guò)程中使用的兩株肺癌細(xì)胞系LTEP-α-2和SPC-α-1中,發(fā)現(xiàn)其對(duì)肺癌細(xì)胞的的惡性生物學(xué)行為起到了抑制作用。我們的研究從細(xì)胞層面證實(shí)病毒感染人體之后可通過(guò)其自身編碼的miRNA分子從基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控層面對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性基因進(jìn)行調(diào)控提供了直接證據(jù),并且進(jìn)一步加深了對(duì)在肺癌發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中病毒及其編碼的miRNA分子調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制的理解。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1551428