本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 干細胞相關(guān)蛋白 PIWI樣蛋白1 miR-154-5p 增殖 凋亡 侵襲 遷移　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的PIWIL1是多種常見惡性腫瘤的癌基因,其異常高表達與腫瘤生物學(xué)進展密切相關(guān)。本研究旨在探討PIWIL1及其上游潛在調(diào)控基因miR-154-5p對膠質(zhì)瘤細胞生長、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)特性的作用及相關(guān)機制,進而為膠質(zhì)瘤的分子診斷和治療提供新的分子標志物和靶點。方法1.實時定量PCR和Western Blot技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤組織,非腫瘤腦組織和膠質(zhì)瘤細胞系(SNB19,U87,A172,LN229,U251,LN308)中PIWIL1在mRNA和蛋白水平表達情況,同時利用實時定量PCR檢測上述標本中miR-154-5p的表達水平。2.通過小RNA干擾(RNAi)技術(shù),降低膠質(zhì)瘤細胞U251和A172中內(nèi)源性PIWIL1的表達后對膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)特性的影響。利用實時定量PCR和Western Blot技術(shù)驗證轉(zhuǎn)染沉默效率,采用MTT、平板克隆集落形成實驗、流式細胞儀技術(shù),體外遷移和侵襲實驗檢測降低膠質(zhì)瘤細胞U251和A172中內(nèi)源性PIWIL1的表達后對膠質(zhì)瘤細胞增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲的影響。3.利用Western Blot技術(shù)檢測降低膠質(zhì)瘤細胞U251和A172中內(nèi)源性PIWIL1的表達后對膠質(zhì)瘤細胞增殖、周期、凋亡遷移和侵襲等相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9)的影響。4.構(gòu)建裸鼠皮下荷U251人腦膠質(zhì)瘤模型,采用多點注射PIWIL1-siRNA觀察體內(nèi)抑制效果,并通過免疫組化技術(shù)檢測瘤塊中PIWIL1的變化。5.將PIWIL1-siRNA和TMZ分別及聯(lián)合作用于U251和A172細胞,然后采用MTT和流式細胞儀技術(shù)檢測不同方式處理后細胞增殖和凋亡的變化。6.膠質(zhì)瘤細胞U251和LN229分別轉(zhuǎn)染miR-154-5p模擬體和抑制劑后,利用實時定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率,采用MTT、平板克隆集落形成實驗、流式細胞儀技術(shù),體外遷移和侵襲實驗檢測膠質(zhì)細胞U251和LN229中miR-154-5p的表達改變后對細胞增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲的影響。7.利用Western Blot技術(shù)檢測改變膠質(zhì)瘤細胞U251和LN229中miR-154-5p的表達后對膠質(zhì)瘤細胞增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲等相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9)的影響。8.生物信息學(xué)預(yù)測miR-154-5p的潛在靶基因,通過構(gòu)建雙熒光素酶報告質(zhì)粒對潛在靶基因進行驗證,通過挽救試驗即轉(zhuǎn)染PIWIL1真核表達質(zhì)粒提高miR-154-5p轉(zhuǎn)染細胞中相應(yīng)蛋白的表達水平,以明確mi R-154-5p通過靶向PIWIL1影響膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)特性。9.構(gòu)建裸鼠皮下荷U251人腦膠質(zhì)瘤模型,采用多點注射miR-154-5p模擬體觀察體內(nèi)抑制效果,并通過實時定量PCR檢測瘤塊中miR-154-5p和PIWIL1的變化,利用免疫組化技術(shù)檢測瘤塊中PIWIL1的表達情況。結(jié)果1.實時定量PCR和Western Blot技術(shù)檢測顯示,膠質(zhì)瘤組織中PIWIL1的表達明顯高于非腫瘤腦組織(P0.05),不同級別膠質(zhì)瘤組織中PIWIL1的表達存在顯著差異(P0.05),膠質(zhì)瘤細胞系(SNB19,U87,A172,LN229,U251,LN308)PIWIL1表達明顯高于非腫瘤腦組織,而膠質(zhì)瘤組織中miR-154-5p的表達明顯低于非腫瘤腦組織(P0.05),不同級別膠質(zhì)瘤組織中miR-154-5p的表達存在顯著差異(P0.05),膠質(zhì)瘤細胞系(SNB19,U87,A172,LN229,U251,LN308)miR-154-5p表達明顯低于非腫瘤腦組織(P0.05)。2.U251和A172細胞中內(nèi)源性PIWIL1被降低后,細胞增殖活性受到顯著抑制作用;細胞克隆集落形成率明顯降低,誘導(dǎo)細胞周期阻滯在G1期,細胞的凋亡顯著增加,顯著降低膠質(zhì)瘤細胞的侵襲和遷移能力;相關(guān)基因的表達發(fā)生顯著的變化:Bcl-2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達降低,Bax和p21表達增強。進一步通過體內(nèi)研究顯示,PIWIL1-siRNA治療能顯著降低腫瘤生長的速度。3.PIWIL1-siRNA聯(lián)合TMZ抑制細胞增殖,增加膠質(zhì)瘤細胞對化療藥物的敏感性,促進膠質(zhì)瘤細胞凋亡。4.過表達膠質(zhì)瘤細胞中miR-154-5p的表達后,膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性受到顯著抑制;細胞克隆集落形成率顯著降低,細胞周期阻滯在G1期,誘導(dǎo)細胞凋亡率顯著增加,細胞的侵襲和遷移能力明顯降低;相關(guān)基因的表達也有顯著的變化:Bcl-2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達降低,Bax和p21表達增強。而抑制膠質(zhì)瘤細胞中mi R-154-5p的表達后,膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性升高;細胞克隆形成率提高,細胞周期在G1期比例降低,細胞的凋亡顯著減少,細胞的侵襲和遷移能力明顯升高;相關(guān)基因的表達也有顯著的變化:Bcl-2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9表達升高,Bax和p21表達降低。進一步通過體內(nèi)研究顯示,miR-154-5p能顯著抑制腫瘤的生長。5.生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,PIWIL1基因為miR-154-5p的潛在靶基因。雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染mi R-154-5p模擬體明顯降低野生型PIWIL1 mRNA的3’UTR熒光素酶活性,而對突變型PIWIL1 mRNA 3’UTR無明顯影響。挽救實驗結(jié)果顯示:升高細胞內(nèi)PIWIL1表達水平后,可有效逆轉(zhuǎn)miR-154-5p對膠質(zhì)瘤細胞生長和遷移的抑制作用。結(jié)論從體內(nèi)和體外水平對PIWIL1的促癌作用和mi R-154-5p的抑癌作用進行了驗證,表明PIWIL1促進膠質(zhì)瘤細胞生長和遷移,而miR-154-5p則起到抑制作用,且miR-154-5p發(fā)揮作用的可能機制是通過抑制膠質(zhì)瘤細胞中PIWIL1的表達。進一步表明miR-154-5p的低表達和PIWIL1的高表達與膠質(zhì)瘤的惡性進展密切相關(guān),因此,miR-154-5p調(diào)控PIWIL1影響膠質(zhì)瘤生物學(xué)特性,為惡性膠質(zhì)瘤基因干預(yù)和分子靶向治療新策略的制定奠定了理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.4

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本文編號：1550859