本文關(guān)鍵詞： 松蘿酸 乳腺癌 活性氧族 c-Jun氨基端激酶 線粒體凋亡途徑　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究中心發(fā)布的GLOBOCAN2012數(shù)據(jù)顯示,癌癥新增病例1410萬,且致死病例820萬。明顯高于GLOBOCAN在2008年公布的數(shù)據(jù),1270萬新增癌癥病例,致死病例760萬,其中乳腺癌的診斷率排名第二位,僅次于肺癌,約占總比利的11.9%[1]。說明乳腺癌已成為阻礙人類健康生活的一大桎梏。僅2012年,全球乳腺癌有170萬的新增病例,比2008的發(fā)病率增長超過20%,且病死率增長盡14%,可見其發(fā)展形勢之嚴(yán)峻[1]。目前手術(shù)治療、放療、化療及內(nèi)分泌治療為臨床的經(jīng)典治療手段,但因乳腺癌的分型及病因的不同,無差別治療對患者產(chǎn)生極大的副作用,也大大提高了乳腺癌的病死率。因此,從乳腺癌的病因出發(fā),尋找特異性的靶向治療藥物及方案是醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題。大量研究發(fā)現(xiàn)從我國傳統(tǒng)中草藥中提取的天然產(chǎn)物具有高效低毒的抗腫瘤作用,其中從地衣植物中提取的松蘿酸具有可抑制多種腫瘤的作用,且能減緩乳腺癌的生長,但其機(jī)制和通路尚不清楚[2,3]。研究目的:本論文研究松蘿酸對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響及產(chǎn)生的機(jī)制,探討松蘿酸通過何種途徑的調(diào)節(jié)作用,參與抑制乳腺腫瘤增殖,闡述松蘿酸對體內(nèi)抑制乳腺癌荷瘤發(fā)生發(fā)展的明確作用及其較好安全性的優(yōu)勢,為臨床乳腺癌治療藥物的選擇提供理論基礎(chǔ)。研究內(nèi)容:MTT法檢測松蘿酸對不同種系的乳腺癌細(xì)胞活性的抑制作用;流式細(xì)胞儀檢測松蘿酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用;用DCFH-DA探針(DCFH-DA為氧化敏感的熒光探針DCFH-DA。它能穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),與ROS反應(yīng)可轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)出熒光的DCF。通過檢測熒光強(qiáng)度可以間接反映細(xì)胞氧化應(yīng)激的程度。)檢測經(jīng)松蘿酸刺激后細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的變化,Western blot方法檢測松蘿酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的相關(guān)蛋白的表達(dá),用乳腺癌荷瘤裸鼠模型初步評價松蘿酸的體內(nèi)抗乳腺癌活性和安全性。研究方法與結(jié)果:1.松蘿酸可通過ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑特異性殺傷乳腺癌細(xì)胞不同濃度(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100μM)松蘿酸與三種乳腺癌細(xì)胞(人乳癌細(xì)胞系MCF-7、人三陰乳癌細(xì)胞系MDA-MB-231、人乳腺腺癌細(xì)胞系SK-BR-3)及正常乳腺細(xì)胞(正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A)分別共培養(yǎng)24和48 h,MTT法檢測松蘿酸對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制現(xiàn)象;流式細(xì)胞儀檢測松蘿酸誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡情況;給予DCFH-DA探針后通過流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡檢測MCF-7細(xì)胞經(jīng)不同濃度(0、12.5、25、50μM)的松蘿酸培養(yǎng)24 h后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化,同時用流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位的變化,用試劑盒檢測Caspase-3活性的變化;同時用ROS的抑制劑NAC(5 m M)驗證松蘿酸誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生對細(xì)胞凋亡的影響;并用JNK的抑制劑SP600125(5 m M)驗證MAPK途徑傳導(dǎo)ROS介導(dǎo)凋亡信號的影響;用Western blot方法檢測給藥24 h細(xì)胞中JNK、c-Jun、ERK、Bax/Bcl-2、Cytochrome-c、Caspase-3和PARP的表達(dá)。結(jié)果表明松蘿酸在MCF7、MDA-MB-231、SK-BR-3、MCF-10A細(xì)胞24 h時的IC50值分別為34.12±1.25μM、38.41±1.64μM、48.07±1.52μM、87.69±1.04μM,表明松蘿酸可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,同時對正常的乳腺癌細(xì)胞毒性作用較小,但成時間或劑量依賴性的殺傷三種乳腺癌細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率顯著上升(P0.05);DCFH-DA探針檢測表明經(jīng)不同濃度松蘿酸培養(yǎng)24 h后的MCF-7中ROS的增加具有劑量依賴性,流式細(xì)胞儀檢測表明松蘿酸亦可增加細(xì)胞線粒體膜的通透性,Annexin V-PI雙染色結(jié)果顯示松蘿酸作用24 h后MCF-7細(xì)胞的凋亡率較對照組顯著增高,試劑盒檢測表明松蘿酸可顯著增加Caspase-3的活性,Western blot檢測結(jié)果顯示JNK、Cytochrome-c、Caspase-3和PARP的表達(dá)顯著上調(diào),Bax/Bcl-2的比例顯著升高,表明可松蘿酸通過ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑特異性殺傷乳腺癌細(xì)胞。我們進(jìn)一步通過應(yīng)用ROS的抑制劑NAC和JNK抑制劑SP600125可逆轉(zhuǎn)松蘿酸引起的MCF-7細(xì)胞凋亡作用,同時Western blot結(jié)果示Bax/Bcl-2、Cytochrome-c、Caspase-3、PARP表達(dá)有變化且能被NAC和SP600125逆轉(zhuǎn),均證明松蘿酸可通過ROS激活MAPK途徑再經(jīng)線粒體凋亡途徑,終而激活Caspase-3引起乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡。2.從動物體內(nèi)實驗驗證松蘿酸對乳腺癌增殖的抑制作用。建立裸鼠動物模型,按治療時所給藥物濃度分為生理鹽水組、25mg/kg松蘿酸組、50mg/kg松蘿酸組、100 mg/kg松蘿酸組、25mg/kg環(huán)磷酰胺組,每3天測量一次腫瘤體積及裸鼠的體重。21天后處死裸鼠取出腫瘤,測量重量,并用TUNEL試劑盒檢測腫瘤的凋亡情況。結(jié)果表明,松蘿酸可顯著抑制人乳腺癌荷瘤的生長曲線和重量,且抗腫瘤作用呈劑量依賴性,高劑量100mg/kg松蘿酸組的抗腫瘤效果高于環(huán)磷酰胺組,且TUNEL染色結(jié)果進(jìn)一步證實松蘿酸可通過增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的凋亡率而抑制荷瘤生長。從裸鼠的體重變化可以看出,經(jīng)松蘿酸治療的裸鼠無論劑量大小其體重的增長與生理鹽水組保持一致,而陽性藥環(huán)磷酰胺組的裸鼠體重明顯下降,表明松蘿酸具備高效低毒的體內(nèi)抗腫瘤作用。研究結(jié)論:松蘿酸可通過產(chǎn)生大量的ROS,激活JNK蛋白,引起B(yǎng)cl-2、Bax及細(xì)胞色素c的改變,從而不可逆的激活Caspase-3,從而通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞死亡,體內(nèi)、外實驗均表明松蘿酸具有顯著的抗乳腺癌作用,有望進(jìn)一步開發(fā)為乳腺癌治療藥物。
[Abstract]:Background : According to GLOBOCAN2012 data published by the International Cancer Research Center of the World Health Organization , there were 14 million new cases of cancer and 8.2 million deaths , which were significantly higher than those published by GLOBOCAN in 2008 , with a mortality rate of 7.6 million , of which the diagnosis rate of breast cancer ranked second , followed by lung cancer , accounting for 11.9 % of total Billy . Breast cancer has become a shackle of human health . In 2012 alone , there were 1.7 million new cases of global breast cancer , more than 20 % more than in 2008 and 14 % in mortality . Objective : To study the effect of pine - acid on the proliferation of breast cancer cell line MCF - 7 by MTT assay . The apoptosis rate of MCF - 7 cells was significantly higher than that in control group .

【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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