本文關(guān)鍵詞： 肝細胞性肝癌 肝星狀細胞 Sorafenib 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化　出處：《南京醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:肝細胞性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)的發(fā)生通常伴有慢性炎癥與纖維化,肝星狀細胞(Hepatic stellate cells,HSCs)在炎癥與纖維化過程中起到重要作用并構(gòu)成HCC的腫瘤微環(huán)境。目的:共培養(yǎng)HSCs與HCC細胞,評價共培養(yǎng)體系中HCC細胞對靶向藥物Sorafenib的敏感性,并檢測共培養(yǎng)情況下HCC細胞表型是否存在變化。進一步深入研究HSCs引起HCC細胞對Sorafenib敏感性變化以及遷移侵襲能力變化的機制。方法:應(yīng)用MTT法檢測共培養(yǎng)條件下HCC細胞對Sorafenib敏感性的變化,進一步通過ELISA、Western Blotting、q PCR等方法檢測與HSCs共培養(yǎng)后HCC細胞內(nèi)可能導致Sorafenib敏感性變化的信號通路改變,并使用相應(yīng)靶點的抑制劑干擾共培養(yǎng)的作用進行驗證。另一方面,Western Blotting、q PCR方法檢測HCC細胞內(nèi)EMT相關(guān)蛋白、基因變化,劃痕愈合實驗、Transwell檢測HCC細胞遷移、侵襲能力,使用si RNA干擾可能引起EMT的靶點后檢測HCC細胞的EMT相關(guān)蛋白與遷移、侵襲能力。聯(lián)合HSCs建立裸鼠原位腫瘤模型,檢測肺轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果:首先,我們發(fā)現(xiàn)Sorafenib通過凋亡途徑抑制HCC細胞增殖,使用HSCs與HCC細胞共培養(yǎng)后,HCC細胞對Sorafenib的敏感性明顯降低并且凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、9、PARP有所減少,說明共培養(yǎng)引起HCC細胞對Sorafenib的耐受。HSCs條件培養(yǎng)基中的HGF水平明顯升高,而且共培養(yǎng)后HCC細胞存活相關(guān)通路中AKT、STAT3被激活,外源性HGF作用于HCC細胞能夠引起Sorafenib耐受,AKT、c-Met抑制劑能夠抵消共培養(yǎng)引起的耐藥,而STAT3激活不受上述抑制劑影響。然而共培養(yǎng)體系中STAT3明顯激活,說明其激活可能由其他可溶性因子介導。抑制STAT3上游的JAK能夠抑制STAT3激活并同樣改善共培養(yǎng)引起的Sorafenib耐藥,STAT3抑制劑S3I-201同樣可以增加Sorafenib敏感性。其次,HSCs與HCC細胞共培養(yǎng)引起HCC細胞形態(tài)變化,這種變化與EMT誘導因子TGF-β引起的形態(tài)改變類似,與HSC共培養(yǎng)后HCC細胞的遷移與侵襲能力有所增強,上皮表型相關(guān)蛋白E-Cadherin減少、間質(zhì)表型標記物Vimentin增加,免疫熒光染色顯示共培養(yǎng)后HCC細胞Vimentin增加,而且m RNA變化與之一致,證實HSCs誘導HCC細胞發(fā)生了EMT�？赡芤餎MT的信號通路關(guān)鍵蛋白p-AKT、p-STAT3均明顯增加,使用si RNA干擾這些靶點并檢測E-Cadherin發(fā)現(xiàn)干擾AKT、ERK均不能影響共培養(yǎng)導致的EMT現(xiàn)象,而只有干擾STAT3才能逆轉(zhuǎn)這一過程,并且干擾STAT3后HCC細胞的遷移侵襲能力減弱。HSCs條件培養(yǎng)基與HCC單獨培養(yǎng)的細胞培養(yǎng)基中的TGF-β水平無差別。IL-6刺激HCC細胞不能引起EMT發(fā)生,而鞘氨醇1磷酸(Sphingosine-1-phosphate,S1P)刺激能夠引起HCC細胞內(nèi)STAT3持續(xù)激活并導致EMT。干擾S1P受體S1PR1能夠降低HCC細胞的遷移與侵襲能力,并且通過STAT3/Slug進一步抑制共培養(yǎng)引起的EMT。同時注射HSCs能夠增加裸鼠原位HCC腫瘤的轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論:HSCs能夠通過分泌HGF激活HCC細胞內(nèi)的c-Met/AKT通路從而引起Sorafenib耐藥,另外HSCs還可通過激活JAK/STAT3引起Sorafenib耐藥,分別靶向這兩條通路均可以增加Sorafenib的敏感性;HSCs與HCC細胞共培養(yǎng)后引起EMT并促進HCC細胞遷移侵襲,S1P可能是HSCs與HCC細胞間交互作用的重要分子,HSCs可能通過S1PR1/STAT3/Slug引起HCC細胞發(fā)生EMT。
[Abstract]:Background: hepatocellular carcinoma (Hepatocellular Carcinoma, HCC) the occurrence is usually accompanied by chronic inflammation and fibrosis, hepatic stellate cells (Hepatic stellate cells, HSCs) in the process of inflammation and fibrosis plays an important role in the tumor microenvironment and HCC. Objective: HSCs co cultured with HCC cells, the sensitivity to the target drug Sorafenib HCC cells in the co culture system of evaluation, and the detection of co cultured HCC cell phenotype under the existence of changes. Further research on the mechanism of HSCs HCC cell sensitivity to Sorafenib change and migration changes caused by invasion. Methods: MTT method was used to detect the changes of HCC cells co cultured under the condition of the sensitivity to Sorafenib, further by ELISA Western, Blotting, HSCs and Q PCR detection method of co culture may lead to Sorafenib signal pathway sensitivity changes in HCC cells, and the corresponding target The effect of co culture of inhibitors interference is verified. On the other hand, Western Blotting, HCC gene change detection of intracellular EMT related protein, Q PCR, wound healing assay, HCC Transwell detection of cell migration, invasion and migration of EMT related protein, HCC cells were detected by using Si RNA interference may cause EMT targets the invasion ability. Combined with HSCs to establish orthotopic tumor model, to detect the changes of pulmonary metastasis ability. Results: first, we found that Sorafenib inhibited the proliferation of HCC cells by apoptosis, using HSCs co cultured with HCC cells, the sensitivity of HCC cells to Sorafenib decreased significantly and apoptosis related protein Caspase3,9, PARP decreased, that caused by Sorafenib the tolerance of.HSCs HCC cell conditioned medium HGF was significantly increased in co cultured and co cultured HCC cell survival pathways in AKT, STAT3 is activated, exogenous Role of HGF in HCC cells can induce Sorafenib tolerance, AKT, c-Met inhibitors can cause the resistance of co culture offset, the activation of STAT3 is not affected by the inhibitor effect. However, in the co culture system of STAT3 was activated, the activation may be mediated by other soluble factors. Inhibition of STAT3 upstream of JAK can inhibit the activation of STAT3 and the same to improve the resistance of co cultured Sorafenib, STAT3 inhibitor S3I-201 can increase the sensitivity of Sorafenib. Secondly, HSCs HCC cells were co cultured with HCC cells induced by morphological changes, the changes induced by EMT and factor TGF- beta induced morphological changes similar to HSC were co cultured with the migration and invasion of HCC cells enhanced epithelial phenotype correlation protein E-Cadherin decreased, mesenchymal marker Vimentin, immunofluorescence staining showed that Vimentin co cultured HCC cells increased, and the change of RNA and one of M To confirm a EMT. may cause the EMT signaling pathway in HCC cells induced by HSCs protein p-AKT, p-STAT3 was significantly increased, the use of Si RNA interfere with the target detection of E-Cadherin and AKT EMT found that interference, caused by co culture of ERK were not affected, but only interfere with the process of STAT3 can be reversed, and the interference of STAT3 the migration and invasion of HCC cells reduced.HSCs conditioned medium and HCC cells cultured alone had no difference between the.IL-6 stimulation of HCC cells induced by EMT can occur in the medium of TGF- beta level training, and sphingosine 1 phosphate (Sphingosine-1-phosphate, S1P) stimulation on HCC cells and lead to sustained activation of STAT3 EMT. interference S1P receptor S1PR1 can reduce the migration and the invasion ability of HCC cells, and further inhibit the transfer ability by STAT3/Slug co culture induced EMT. and HSCs injection can increase HCC tumor in nude mice. Conclusion: HSCs can secrete HGF through activation of the c-Met/AKT pathway in HCC cells due to Sorafenib resistance, HSCs also can be caused by the activation of JAK/STAT3 Sorafenib resistance, respectively, targeting these two pathways can increase the sensitivity of Sorafenib; HSCs co cultured with HCC cells induced by EMT and HCC to promote cell migration and invasion, S1P may be an important molecular HSCs and HCC cell interaction, HSCs through S1PR1/STAT3/Slug of HCC cells induced by EMT.

【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 彭岳;趙鐵建;謝海源;韋燕飛;;細胞培養(yǎng)實驗中一些細節(jié)問題的探討[J];中華中醫(yī)藥學刊;2009年06期

2 鄭麗君;夏文美;童村;;HeLa細胞的培養(yǎng)與使用[J];醫(yī)藥工業(yè);1983年10期

3 李少英;李月秋;朱金玲;;三種細胞生長狀況的觀察[J];佳木斯醫(yī)學院學報;1995年06期

4 嚴國俊;裴燕芳;朱貞宏;吳潔穎;潘金火;;實時細胞電子分析技術(shù)的應(yīng)用研究進展[J];中國藥學雜志;2014年03期

5 陳必良,穆潤華,馬向東,王德堂,辛曉燕,鄭維國,嚴瑞蘭;特異性反義寡核苷酸對含HPV16的SiHa細胞的作用[J];第四軍醫(yī)大學學報;2000年03期

6 孟洪弟,戚豫,潘虹,吳希如;無線粒體DNA的ρ°206細胞的培養(yǎng)及其呼吸鏈功能損害[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2000年03期

7 何秉燕;鄧長生;鄒典定;劉湘芬;易有榮;;G-CSF對洛伐他汀誘導的K562細胞內(nèi)酸堿度及凋亡的影響[J];中華血液學雜志;2006年07期

8 黃靜紅;李德如;閻國富;;蘿卜硫素對HaCaT細胞的影響研究[J];中國美容醫(yī)學;2010年11期

9 章靜波,葉祝三;保護正常組織和細胞——腫瘤化療研究中的一個動向[J];國外醫(yī)學參考資料(腫瘤學分冊);1978年01期

10 章靜波;薛新華;;細胞松弛菌素D對EC_a-109細胞的作用[J];解剖學報;1979年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉令九;趙小琳;岳立廣;徐艷玲;李淑焱;侯麗娟;隋紅;姜崴;謝寶生;李勇;劉兵;李海濱;;細胞工廠培養(yǎng)人胚肺二倍體細胞制備凍干甲型肝炎減毒活疫苗[A];2011中國生物制品年會暨第十一次全國生物制品學術(shù)研討會論文集[C];2011年

2 宋征;;應(yīng)用Bhas42細胞試驗檢測22個腫瘤促長基因標志物[A];2013年（第三屆）中國藥物毒理學年會暨藥物非臨床安全性評價研究論壇論文摘要[C];2013年

3 谷彬;張輝;喻澤蘭;;依地福新對Jurkat細胞生長抑制機制的研究[A];2009醫(yī)學前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學術(shù)會議論文集[C];2009年

4 武冬梅;李秀娥;葛莉亞;袁星;;雙酚-A對MCF-7細胞伏安行為的影響[A];第五屆全國環(huán)境化學大會摘要集[C];2009年

5 李曉飛;呂超;吳小榮;韓慶玲;王杰;易宗春;;鉛和鋁離子對K562細胞紅系分化的影響[A];全國生化/工業(yè)與衛(wèi)生毒理學學術(shù)會議論文集[C];2010年

6 宋為民;郭波;;復方甘草酸苷對HaCaT細胞表達AQP3的影響[A];2011全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學術(shù)會議論文匯編[C];2011年

7 劉魯明;錢華;陳震;林勝友;黃挺;;參麥注射液對腫瘤細胞環(huán)核甘酸的影響[A];全國中醫(yī)藥科研與教學改革研討會論文集[C];2000年

8 張雪玲;糜漫天;李等松;韋娜;張乾勇;楊志祥;;Lovastatin對HL-60細胞HMG-CoA還原酶mRNA表達及細胞增殖功能的影響[A];中國營養(yǎng)學會特殊營養(yǎng)第五屆學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

9 房佰俊;廖聯(lián)明;楊少光;史明霞;趙春華;;胎兒骨髓源原始干細胞分離純化及其生物學特性的初步研究[A];第九屆全國實驗血液學會議論文摘要匯編[C];2003年

10 李曉軍;朱傳東;汪萍;賈麗;陳芳芳;夏欣一;陳龍邦;;人Id3基因在A549細胞中的表達及對細胞生長功能的研究[A];第六屆全國免疫學學術(shù)大會論文集[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 吳春燕 通訊員 寧習源 吳劍鵬;人類情緒可影響干細胞生長[N];光明日報;2014年

2 馮衛(wèi)東;老化干細胞可轉(zhuǎn)變成年輕干細胞[N];科技日報;2012年

3 常麗君;科學家闡明核內(nèi)周期運作機制[N];科技日報;2011年

4 本版編輯邋杜華斌 邰舉 毛文波 顧鋼 陳超 何屹 毛黎;2007年世界科技發(fā)展回顧(六)[N];科技日報;2008年

5 通訊員 李靜;廈大教授發(fā)現(xiàn)細胞防癌“玄機”[N];廈門日報;2009年

6 永誠;美發(fā)現(xiàn)控制細胞生長的蛋白質(zhì)[N];中國醫(yī)藥報;2000年

7 記者 張孟軍;加找到刺激干細胞生長分子[N];科技日報;2001年

8 張?zhí)锟?干細胞研究精彩紛呈[N];中國醫(yī)藥報;2011年

9 邵薇/編譯;T細胞的非凡能力[N];北京科技報;2003年

10 經(jīng)天;控制細胞生長的蛋白質(zhì)[N];中藥事業(yè)報;2000年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 蔣淵;缺氧肝癌細胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子機制的研究[D];第三軍醫(yī)大學;2015年

2 張廣;肝星狀細胞在肝癌細胞惡性行為中的作用及機制研究[D];南京醫(yī)科大學;2015年

3 楊小超;陽離子配體修飾的納米金用于細胞轉(zhuǎn)運和微囊自組裝研究[D];重慶大學;2010年

4 葉玲玲;基于生物素誘導表達系統(tǒng)的HEK293細胞多基因代謝工程改造[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2011年

5 梁國斌;產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽過程控制與優(yōu)化[D];江南大學;2008年

6 楊海虹;鈣池操縱性鈣內(nèi)流在人肺腺癌A549細胞中的研究[D];南方醫(yī)科大學;2012年

7 常玉娟;基于Nrf2/ARE通路辛開苦降方胃康寧對人胃粘膜上皮細胞SOD2、GSTP1相關(guān)調(diào)控機制的研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2015年

8 楊麗君;人Fcα/μR的表達與功能的初步研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2008年

9 李曼;DRC3f及eRF3b在肝病發(fā)生發(fā)展中作用機制的初步研究[D];河北醫(yī)科大學;2011年

10 王永軍;凋亡/增殖平衡失調(diào)在肺癌發(fā)生中作用的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;1997年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 柯自立;硫酸鎂對6-羥基多巴胺損傷的SH-SY5Y細胞的保護作用[D];福建醫(yī)科大學;2015年

2 李婷婷;細胞穿透肽VP22對抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究[D];川北醫(yī)學院;2015年

3 王靜;環(huán)氧化物酶抑制劑NS-398聯(lián)合奧沙利鉑對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學;2015年

4 鄭祿祿;番茄紅素對轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的PC12細胞線粒體的保護作用[D];河北醫(yī)科大學;2015年

5 宋晨源;氯化銨對人正常肝細胞系changliver中二氫乳清酸脫氫酶表達的影響[D];鄭州大學;2015年

6 張莉;白藜蘆醇體外抑制腸道病毒71型的作用機制研究[D];蘇州大學;2015年

7 高華武;富硒芪云抗腫瘤作用及其機制的實驗研究[D];安徽中醫(yī)藥大學;2015年

8 宋加奎;丹參對人胃癌SGC-7901細胞化療敏感性的影響[D];安徽中醫(yī)藥大學;2015年

9 許雅鑫;尼古丁對NCI-H1975和NCI-H460細胞促進增殖作用及對PI3K/Akt通路的影響研究[D];山西醫(yī)科大學;2015年

10 高娜;加減駐景方含藥血清對二氯化鈷誘導后ARPE-19細胞表達VEGF及HIF-1α的影響[D];青海大學;2015年

，

本文編號：1545171