發(fā)布時(shí)間：2018-02-26 18:25

  本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 重新自組裝 抗血管生成 抗增殖 納米粒　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:開發(fā)可跨越血腦屏障(BBB)發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、腫瘤內(nèi)皮依賴性血管(EDV)和血管生成擬態(tài)(VM)的可重新自組裝肝素納米粒,考察其體內(nèi)外生物活性和作用機(jī)制,為膠質(zhì)瘤的藥物研發(fā)提供更好的思路,為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法:通過核磁共振氫譜(1H NMR)、紫外分光光度計(jì)(UV)、BCA蛋白定量和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MOLDI-TOF)驗(yàn)證可重新自組裝肝素納米粒(H-S-RNPs1)是否制備成功;透射電子顯微鏡(TEM)和動態(tài)光散射(DLS)研究其在水溶液和BBB環(huán)境中的表征;在體外血腦屏障模型中研究其在不同條件下的BBB穿透能力;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、共聚焦顯微鏡、CCK-8、三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)考察其在體外對EphA2和αvβ3的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的靶向能力、增殖和微管形成抑制能力;建立皮下/原位膠質(zhì)瘤模型,通過活體成像考察其體內(nèi)生物分布,并考察其體內(nèi)抑瘤效果;通過免疫組化Ki67、CD34/PAS雙重染色研究其作用機(jī)制;HE染色評價(jià)其體內(nèi)安全性。結(jié)果:1HNMR、UV、BCA蛋白定量和MOLDI-TOF結(jié)果證實(shí)成功制備H-S-R NPs1,其 SWL 和 cRGD 肽含量分別是 12.57%和 7.61%(w/w);TEM 和 DLS結(jié)果顯示H-S-RNPs約為均勻單分散的球形粒子,在水中的粒徑為164± 16nm,在血液模擬環(huán)境中粒徑變小為63 ± 11 nm;體外血腦屏障模型結(jié)果顯示這種更小的粒徑有利于其跨越BBB;流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡EphA2和αvβ3高表達(dá)的U87、U251、HUVEC細(xì)胞對單靶向的H-S 1、H-R 1和雙靶向的H-S-RNPs1都有良好的攝取,而EphA2和αvβ3低表達(dá)的HEB細(xì)胞攝取較低;CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H-S-RNPs1具有相對H-S 1、H-R 1和H-S-RNPs2更好的EphA2和αvβ3過表達(dá)細(xì)胞殺傷效果,而所有聚合物對HEB細(xì)胞都沒有明顯的殺傷效果;微管形成實(shí)驗(yàn)表明H-S-RNPs1在U87、U251和HUVEC上展現(xiàn)了比H-S 1和H-R 1更好的抑制微管形成的效果;體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,H-S-R NPs1在U251皮下膠質(zhì)瘤荷瘤鼠和U87原位膠質(zhì)瘤荷瘤鼠中都可以快速蓄積到腫瘤部位(0.5小時(shí)),12小時(shí)達(dá)到峰值,然后逐漸衰減;離體器官成像和組織切片共聚焦顯微鏡結(jié)果證實(shí)H-S-RNPs1可跨越血/腫瘤屏障到達(dá)膠質(zhì)瘤組織;體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,H-S-RNPs1在皮下/原位膠質(zhì)瘤荷瘤鼠中均有良好的抑制膠質(zhì)瘤生長和延長荷瘤鼠生存期的效果;免疫組化結(jié)果顯示H-S-R NPs1治療組的腫瘤中Ki67的表達(dá)率(20.39 ± 2.57%)明顯低于對照組(89.69 ± 3.74%)和H-S 1治療組(58.78±4.19%),而H-S-RNPs1 治療組(11.33 ±0.58)的腫瘤中包含EDV(CD34+)和VM(CD34-/PAS+)的管道結(jié)構(gòu)也明顯少于對照組(62.33±9.5)和H-S1治療組(30.67 ±2.89);HE染色結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)H-S-RNPs1具有明顯的器官毒性。結(jié)論:本研究制備的可重新自組裝肝素納米粒是抗膠質(zhì)瘤治療的理想選擇。
[Abstract]:Objective: to develop across the blood-brain barrier (BBB) inhibit glioma cell proliferation, tumor endothelium dependent (EDV) and vasculogenic mimicry (VM) can be re assembled heparin nanoparticles and investigate the in vitro and in vivo biological activity and mechanism of action, research and development to provide better insight into the drug of glioma, provide the basis for the clinical application. Methods: by nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H NMR), ultraviolet spectrophotometer (UV), BCA protein and matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MOLDI-TOF) to verify the self-assembly of heparin nanoparticles (H-S-RNPs1) is successfully prepared; transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) study in aqueous solution and in BBB characterization; in vitro BBB model in the study on the condition of different BBB penetration; using flow cytometry, confocal microscopy, CCK-8, experimental study in the three-dimensional culture In vitro of EphA2 and alpha v beta 3 glioma cells and vascular endothelial cell targeting ability, proliferation and inhibition of microtubule formation; establish subcutaneous / orthotopic glioma model by in vivo imaging to investigate the biodistribution, and investigate the in vivo antitumor effect; by immunohistochemical Ki67, research on its mechanism CD34/PAS double staining; HE staining to evaluate its safety in vivo. Results: 1HNMR, UV, BCA protein and MOLDI-TOF results confirmed successful preparation of H-S-R NPs1, the SWL and the cRGD peptide content were 12.57% and 7.61% (w/w); TEM and DLS showed that H-S-RNPs is about homogeneous spherical particles dispersed in water. The particle size was 164 + 16nm, the blood in the simulated environment the size of 63 + 11 nm; in vitro BBB model results show that the smaller particle size is conducive to the cross BBB; flow cytometry and confocal microscopy EphA2 and alpha v beta 3 meter high As U87, U251, HUVEC cells to single target H-S 1, H-S-RNPs1 H-R 1 and double targeting have good uptake, while the HEB cell uptake of EphA2 and low expression of alpha v beta 3 low CCK-8; experimental results show that H-S-RNPs1 has a relative H-S 1, H-R 1 and H-S-RNPs2 EphA2 and better alpha v beta 3 expression cell killing effect on HEB cells, and all the polymers have no obvious cytotoxic effect; microtubule formation experiments show that H-S-RNPs1 in U87, U251 and HUVEC show the formation ratio of H-S 1 and H-R 1 inhibited microtubule better effect; distribution in vivo experimental results show that the H-S-R NPs1 rapid accumulation of tumor site can the U251 subcutaneous glioma rats and in situ U87 glioma rats (0.5 hours), 12 hours to reach the peak, then gradually decreased; isolated organ tissue imaging and confocal microscopy confirmed that H-S-RNPs1 can cross the blood / tumor barrier to glioma Tumor tissue; tumor inhibition in vivo. The experimental results show that the H-S-RNPs1 / were in situ in subcutaneous glioma rats in good inhibition of glioma growth and prolong the survival time of tumor bearing rats; immunohistochemistry showed that the expression of Ki67 H-S-R NPs1 treatment group tumor rate (20.39 + 2.57%) was significantly lower than the control group (89.69 + 3.74%) and H-S 1 treatment group (58.78 + 4.19%), and H-S-RNPs1 group (11.33 + 0.58) of the tumors contain EDV (CD34+) and VM (CD34-/PAS+) of the pipeline structure is significantly less than the control group (62.33 + 9.5) and H-S1 group (30.67 + 2.89); HE staining H-S-RNPs1 has found no obvious organ toxicity. Conclusion: This study prepared to self-assembly of heparin nanoparticles is ideal for anti glioma treatment.

【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R739.41

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本文編號：1539138