本文關(guān)鍵詞： miRNA-96 SARI 靶基因 非小細胞肺癌 遷移 侵襲　出處：《天津醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究目的肺癌已成為全球?qū)θ祟惤】低{最大的惡性腫瘤之一,在我國肺癌的發(fā)病率和死亡率均高居所有惡性腫瘤的首位。手術(shù)治療仍是目前唯一的可能治愈肺癌的手段,但是僅不足一半的患者有機會接受根治性手術(shù)治療,術(shù)后5年生存率僅為30-60%。肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響患者療效和生存的關(guān)鍵因素,但由于肺癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制目前仍然不清楚,缺乏有效的治療手段。因此,積極探索肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找肺癌治療的新方法,對提高患者預后有重要的現(xiàn)實意義。激活蛋白-1抑制因子(SARI,受干擾素調(diào)節(jié)),是一種受I型干擾素誘導的早期反應基因,是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型抑癌基因,可以選擇性抑制腫瘤細胞的生長作用。SARI在多種正常組織細胞中均有表達,而在多種腫瘤中不表達或表達量下降。本課題小組的前期研究結(jié)果顯示SARI與肺腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移有明顯的關(guān)系,然而其在肺癌組織中表達與調(diào)控機制尚不清楚。微小RNA(mi RNA)是一類內(nèi)源性的單鏈非編碼RNA,可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達,mi RNA的表達異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)mi RNA-96在多種惡性腫瘤中高表達,并與腫瘤細胞的分化、增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移過程相關(guān),呈癌基因的功能。在NSCLC中mi RNA-96的作用機制仍不明確,最近研究結(jié)果顯示mi RNA-96在NSCLC中表達升高,在肺癌細胞系中mi RNA-96表達亦上調(diào)。本研究旨在明確SARI及mi RNA-96在NSCLC的表達情況,分析mi RNA-96對SARI可能的調(diào)控機制,并探討對肺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響,為闡明NSCLC的轉(zhuǎn)移機制和尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。研究方法1、利用免疫組化法檢測SARI蛋白在120例NSCLC患者的石蠟組織標本中的表達,分析SARI表達水平與NSCLC臨床病理特征及預后之間的關(guān)系。利用RT-PCR方法分析30例NSCLC患者新鮮癌組織與癌旁組織標本中SARI m RNA的表達情況。2、利用q RT-PCR方法檢測30例NSCLC患者新鮮癌組織與癌旁組織標本mi RNA-96的表達,分析其表達水平與患者臨床病理因素的關(guān)系。進一步分析mi RNA-96與SARI在NSCLC中之間的表達相關(guān)性。3、驗證mi RNA-96對SARI基因的靶向調(diào)控,利用Target Scan,mi Randa和Microcosm Targets等信息學軟件分析mi RNA-96與SARI基因可能的作用位點,熒光素酶報告實驗驗證mi RNA-96對SARI的直接負性調(diào)控。在A549細胞中抑制mi RNA-96水平后利用RT-PCR和Western blotting法檢測SARI m RNA和蛋白水平的改變。4、分析mi RNA-96調(diào)控SARI對A549細胞遷移侵襲能力的影響,在A549細胞中轉(zhuǎn)染mi RNA-96 inhibitor后,MTT法檢測細胞的增殖水平的變化,劃痕實驗和Transwell侵襲實驗檢測遷移侵襲能力的變化。利用RAN干擾法抑制SARI的蛋白表達,檢測細胞遷移侵襲能力的改變。研究結(jié)果1、免疫組化法檢測結(jié)果顯示在NSCLC中SARI陽性率僅為41.7%(50/120),其中肺腺癌陽性率38.9%(21/54),鱗癌陽性率為43.9%(29/66)。RT-PCR結(jié)果顯示在癌組織中SARI基因的m RNA相對表達水平明顯低于癌旁組織中的相對表達水平(0.17±0.03 vs 0.51±0.11),倍數(shù)變化為0.33,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.028)。在NSCLC中SARI的表達水平與腫瘤分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤TNM分期等密切相關(guān)(P0.05);多因素分析結(jié)果顯示僅淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期與SARI的蛋白表達水平有關(guān)。生存分析結(jié)果顯示SARI蛋白表達陽性者5年生存率明顯高于陰性表達者(67.5%vs 41.6%,χ2=8.993,P=0.003),SARI表達是影響本組NSCLC患者預后的獨立危險因素。2、q RT-PCR檢測顯示在NSCLC癌組織中mi RNA-96的平均表達水平為癌旁組織的2.16±0.92倍,差異有統(tǒng)計學意義(2-ΔΔCt1,P0.05)。mi RNA-96表達與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及T分期顯著相關(guān)(P0.05);與患者的性別、年齡、吸煙狀態(tài)、病理類型、腫瘤部位等無相關(guān)(P0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示在NSCLC中mi RNA-96表達水平與SARI m RNA的表達水平呈負相關(guān)性,(r2=0.623,P=0.019)。3、生物信息學分析提示SARI可能是mi RNA-96的靶基因。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示mi RNA-96能夠抑制含有結(jié)合位點的SARI熒光素酶報告基因的活性,而對突變體及對照組質(zhì)粒的熒光強度沒有影響。在A549細胞中抑制mi RNA-96表達后SARI m RNA和蛋白水平均升高。4、抑制A549細胞中mi RNA-96表達后細胞的增殖、遷移和侵襲能力均明顯的受到抑制;而用下調(diào)SARI的表達水平能促進細胞的遷移和侵襲;共轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示mi RNA-96 inhibitor對腫瘤細胞的遷移及侵襲的抑制作用可以部分地被SARI si RNA削弱。研究結(jié)論1、在NSCLC組織中SARI表達下降,其表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預后相關(guān);抑制SARI的表達后,細胞的遷移和侵襲能力增強,結(jié)果提示SARI在NSCLC的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮抑制作用。2、在NSCLC中mi RNA-96表達升高,其表達水平與腫瘤細胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及T分期相關(guān);抑制mi RNA-96表達后細胞的增殖、遷移、侵襲能力均顯著下降,提示mi RNA對NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移有促進作用。3、SARI為mi RNA-96直接調(diào)控的靶基因,mi RNA-96通過抑制SARI的表達促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

【共引文獻】

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本文編號：1534196