本文關(guān)鍵詞： 細(xì)梗香草皂苷B和C 化合物EM340 Chalocomoracin 凋亡 自噬 粘附和轉(zhuǎn)移 LATS1激酶 YAP蛋白 Hippo信號通路 線粒體自噬 類凋亡　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腫瘤是危害人類健康的難治性多發(fā)病,其危害性僅次于心血管疾病,是導(dǎo)致國內(nèi)人口死亡的第二大原因。由于腫瘤多重耐藥性日益嚴(yán)重,尋找全新結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的抗腫瘤藥物顯得尤為重要。本文分別對天然源的細(xì)梗香草皂苷B(CapilliposideB,CPS-B)、細(xì)梗香草皂苷 C(CapilliposideC,CPS-C)和Chalocomoracin(CMR),以及實(shí)驗(yàn)室合成化合物EM340進(jìn)行了深入地抗腫瘤作用機(jī)制研究。第一部分是關(guān)于天然植物單體化合物CPS-B和CPS-C抗前列腺癌的機(jī)制研究。CPS-B和CPS-C是新型齊墩果烷型三萜皂苷,自植物細(xì)梗香草(Lysimachia capillipes Hemsl,L.capillipes)中分離獲得。前期的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,細(xì)梗香草總皂苷(LysimachiaCapillipes,LC)抗腫瘤作用顯著;但對于其所含單體活性成分CPS-B和CPS-C的抗腫瘤作用機(jī)制還不甚了解。本論文細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)表明CPS-B和CPS-C對前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145的生長和增殖具有顯著的抑制作用;經(jīng)過48小時(shí)作用,CPS-B對PC-3和DU145的半數(shù)抑制濃度分別為3.75 μM和4.0μM,CPS-C對PC-3和DU145的半數(shù)抑制濃度分別為5.53μM和9.99μM。以PC-3細(xì)胞為研究對象,探究CPS-B和CPS-C抗前列腺癌作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CPS-B通過引起細(xì)胞DNA損傷和凋亡,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧,激活A(yù)MPK-mTOR通路,引起細(xì)胞自噬以及細(xì)胞粘附和轉(zhuǎn)移能力喪失最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡;而CPS-C則通過作用于細(xì)胞線粒體,影響MAPK、Caspase和Bcl-2家族蛋白的表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡性死亡。第二部分是關(guān)于化合物EM340抗乳腺癌的機(jī)制研究。本論文首先以YAP為靶目標(biāo),通過報(bào)告基因法篩選出有效抑制YAP表達(dá)的化合物EM340。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,化合物EM340通過激活Hippo信號通路上游的LATS1激酶,引起Hippo通路中心信號蛋白YAP表達(dá)下調(diào),誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的死亡。另一方面,通過阻斷E3泛素化連接酶β-TRCP可有效抑制YAP的下降,說明EM340介導(dǎo)的Hippo信號通路的激活引起了 YAP的泛素化降解。采用RT-PCR和qPCR技術(shù),發(fā)現(xiàn)YAP下游目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子CTGF,Cyr61和干細(xì)胞相關(guān)因子Oct3/4,Sox2,Nanog的表達(dá)被抑制。總之,EM340以LATS1激酶為靶點(diǎn)作用于Hippo信號通路,進(jìn)而引起Hippo下游效應(yīng)子YAP降解,導(dǎo)致YAP下游目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下降,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。第三部分是關(guān)于桑葉中Diels-Alder型化合物Chalocomoracin(CMR)抗前列腺癌和乳腺癌的機(jī)制研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CMR引起了 PC-3和MDA-MB-231細(xì)胞非凋亡性的細(xì)胞質(zhì)空泡死亡現(xiàn)象(LNCaP細(xì)胞無此現(xiàn)象)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CMR介導(dǎo)的PC-3和MDA-MB-231細(xì)胞活性氧增加、線粒體膜電位喪失以及鈣離子失衡引起了細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,LC3-II、泛素化蛋白以及線粒體效應(yīng)子PINK1的合成,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生線粒體自噬;另一方面,CMR也引起了類凋亡抑制因子Alix表達(dá)的下調(diào),提示CMR誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了類凋亡。對LNCaP在CMR作用下呈現(xiàn)的變化進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn),PINK1在CMR介導(dǎo)的細(xì)胞自噬和類凋亡之間扮演著重要的角色。本論文主要的創(chuàng)新性工作如下:(1)首次較深入地研究了 CPS-B和CPS-C抗前列腺癌的作用機(jī)制。(2)基于YAP報(bào)告基因抗腫瘤化合物篩選,首次證明了EM340是LATS1激酶的激活劑。(3)CMR通過新穎的類凋亡途徑介導(dǎo)了前列腺癌PC-3細(xì)胞和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的死亡。
[Abstract]:Tumor is a refractory disease endangering human health, its harm after cardiovascular disease, is the second leading cause of death. Because of the domestic population of multi drug resistance of tumor is becoming increasingly serious, looking for new structures and mechanisms of antitumor drugs is particularly important. This paper capilliposide B of natural sources (CapilliposideB CPS-B), capilliposide C (CapilliposideC, CPS-C) and Chalocomoracin (CMR), as well as the laboratory synthesis of EM340 were studied the antitumor mechanism deeply. The first part is about the research on the mechanism of.CPS-B and CPS-C natural plant compounds CPS-B and CPS-C against prostate cancer is the three new oleanane type saponins. Since the plant Lysimachia capillipes (Lysimachia capillipes, Hemsl, L.capillipes) isolated in vivo. Previous experimental results show that the total saponins of Lysimachia capillipes (LysimachiaCapil Lipes, LC) anti-tumor effect; but for the antitumor mechanism of the monomer containing active components CPS-B and CPS-C are not well understood. The experiment showed that the cell survival rate has significant inhibitory effect on CPS-B and CPS-C on growth and proliferation of cancer cells PC-3 and DU145 prostate; after 48 hours, CPS-B half of the PC-3 and DU145 inhibitory concentrations were 3.75 M and 4 M, CPS-C PC-3 and DU145 on the half inhibitory concentrations were 5.53 M and 9.99 M. in PC-3 cells as the research object, to explore CPS-B and CPS-C anti cancer mechanism of prostate. The experimental results show that the CPS-B caused by injury and apoptosis in DNA cells then, production of ROS induced by activation of the AMPK-mTOR pathway, induced, autophagy and cell adhesion and metastasis loss result in cell death; and CPS-C by acting on the cell mitochondria, effects of MAPK, Caspase and Bcl-2 The expression of proteins and induce apoptosis of death. The second part is about the research on the mechanism of compound EM340 against breast cancer. In this paper, YAP as a target, the reporter gene was screened effectively inhibit the expression of YAP compounds EM340. further experimental results show that the compound EM340 through activation of Hippo signaling pathway upstream of LATS1 kinase. Decrease the expression of Hippo pathway center signal protein YAP, induced cell death in breast cancer cells. On the other hand, the decline in the blocking of the E3 ubiquitin ligase beta -TRCP can effectively inhibit YAP activation, Hippo EM340 mediated signal pathway induced by the ubiquitination of YAP. Using RT-PCR and qPCR technology, YAP downstream target the transcription factor CTGF, Cyr61 and stem cell related factors Oct3/4, Sox2, Nanog expression was inhibited. In short, EM340 to LATS1 kinase targeting on Hippo signaling pathway in. Due to Hippo downstream effectors of YAP degradation, leading to YAP downstream targets of transcription factor expression decreased, eventually leading to cell death. The third part is about the Diels-Alder in mulberry leaves compound Chalocomoracin (CMR) mechanism of anti prostate cancer and breast cancer. The experimental results show that CMR caused PC-3 and MDA-MB-231 cell non apoptotic phenomenon of cytoplasmic vacuoles (LNCaP cell death without this phenomenon). The results showed that oxygen PC-3 and MDA-MB-231 cell activity of CMR mediated increase in mitochondrial membrane potential loss and calcium imbalance caused endoplasmic reticulum stress, LC3-II, ubiquitin protein synthesis and mitochondrial effector of PINK1, causing the cells to produce mitochondrial autophagy; on the other hand also, CMR caused a downregulation of apoptosis inhibitory factor Alix expression, suggesting that the occurrence of the apoptosis induced by CMR cells. The changes of LNCaP in the presence of CMR presentation Further study found that PINK1 plays an important role in autophagy and CMR mediated apoptosis. The main innovative work of this thesis are as follows: (1) the mechanism for the first time more in-depth study of the CPS-B and CPS-C against prostate cancer. (2) the YAP reporter gene based screening of antitumor compounds for the first time. It is proved that EM340 activator of LATS1 kinase. (3) CMR prostate cancer PC-3 cells and breast cancer MDA-MB-231 cell death by apoptosis mediated novel class.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25;R737.9

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