本文關(guān)鍵詞： 結(jié)直腸癌 癌相關(guān)成纖維細胞 TGF-β1 PGP9.5 Smad ERK1/2 PI3K　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)無論是在國外還是國內(nèi)都是常見的惡性腫瘤之一,對人類的健康構(gòu)成了很大威脅。在西方發(fā)達國家,結(jié)直腸癌在由惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡原因中排第二位,在中國也位居第四位。近年來,CRC的發(fā)病率仍具不斷上升趨勢,尤其是在發(fā)達的農(nóng)村地區(qū)和城市,并且發(fā)病時間呈年輕化的趨勢。因此,深入研究探討CRC發(fā)生發(fā)展機制,提高CRC的診斷治療和改善預(yù)后具有重要意義。目前關(guān)于腫瘤疾病的研究,大多集中在腫瘤細胞本身,針對腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展機制的研究已經(jīng)取得一定的進展,關(guān)于其表觀遺傳學(xué)和基因間互作的變化在腫瘤中的作用已有比較一致的看法。但隨著研究的深入,不斷有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生發(fā)展除了跟細胞本身相關(guān)外,還跟腫瘤細胞所處的腫瘤微環(huán)境密切相關(guān),無論是在腫瘤的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移過程中,腫瘤微環(huán)境均扮演著重要角色。腫瘤微環(huán)境的最重要組成部分是腫瘤間質(zhì),而癌相關(guān)成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)被認為是腫瘤間質(zhì)中最主要的細胞,研究表明,其與CRC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。CAFs能與腫瘤細胞發(fā)生相互作用,從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展,這其中涉及到多條信號通路,例如PDGF、TGF-β等,而現(xiàn)今公認的最經(jīng)典的一條通路為TGF-β信號通路。TGF-β在腫瘤發(fā)展的不同時期具有不同作用,例如其在腫瘤發(fā)生的早期具有抑癌作用,而到了后期卻發(fā)揮促癌作用,對于這種現(xiàn)象,目前認為是由于TGF-β所處的環(huán)境不同而造成的。在微環(huán)境和腫瘤的相互作用過程中,TGF-β1能誘導(dǎo)成纖維細胞活化,轉(zhuǎn)化為表達α-SMA的CAFs,而CAFs具有促進腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的作用。不管是在體外細胞實驗,還是在動物中的實驗均表明,TGF-β能誘導(dǎo)正常成纖維細胞活化,從而促進腫瘤的生長。雖然TGF-β通路在腫瘤-間質(zhì)的相互作用中具有重要作用,并已經(jīng)引起人們的重視,但關(guān)于其發(fā)生作用的機制目前還未完全清楚。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的CAFs表達PGP9.5。PGP9.5(Protein gene product,蛋白基因產(chǎn)物),又稱為UCH-L1 (ubiquitin C terminal hydrolase-L1,泛素羧基末端水解酶-1),屬于泛素肽羧基末端水解酶類家族,在細胞的水解過程中發(fā)揮作用,具有調(diào)控細胞進程如細胞周期等功能。PGP9.5首次在神經(jīng)源性腫瘤中發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)元分化的整個過程廣泛表達,被認為是神經(jīng)源性腫瘤的標志物。但隨著研究的深入,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在多數(shù)腫瘤如食管癌、甲狀腺髓樣癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等也同樣呈現(xiàn)高表達。在腫瘤生長過程中,PGP9.5會誘導(dǎo)細胞周期蛋白泛素化的上調(diào),促進細胞的失控性生長,是激活癌基因的關(guān)鍵因素之一。已有研究證實,在由結(jié)直腸炎惡變?yōu)榘┑倪^程中,PGP9.5發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在患有結(jié)直腸癌的出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中,PGP9.5呈現(xiàn)低甲基化,表明其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。并且PGP9.5表達也與癌的病理期及進展密切相關(guān),PGP9.5表達高的患者生存率下降。因此,PGP9.5在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。TGF-β能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的CAFs表達PGP9.5,但具體機制并不清楚。因此本研究擬進一步探討其中的具體機制,明確TGF-β具體通過何種信號通路促進CAFs表達PGP9.5,從而對結(jié)直腸癌細胞生長發(fā)揮調(diào)控。此研究的進行可為結(jié)直腸癌的診斷、治療提供新思路和新靶點。研究目的CAFs在腫瘤生長進展中的作用目前已引起足夠重視,而TGF-β在CAFs活化過程中的作用也有諸多研究證明,并且PGP9.5在CRC中的重要地位也比較明確。研究表明,TGF-β可以誘導(dǎo)CAFs表達PGP9.5,但具體的分子機制還未有研究報道。因此,本研究針對TGF-β/CAFs/PGP95間的具體作用機制展開研究探討,明確TGF-β通過何種通路促進PGP9.5在CAFs中分泌表達,從而發(fā)揮其促進結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用。方法和結(jié)果第一部分目的：進一步實驗驗證TGF-β1誘導(dǎo)活化人胚肺成纖維細胞WI-38進一步活化并分泌表達PGP9.5。方法：誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得活化的人胚肺成纖維細胞WI-38(CAFs),加入TGF-β1刺激,用免疫熒光檢測α-SMA的表達。在TGF-β1作用的不同時間點收集細胞和培養(yǎng)基,用Western blot檢測PGP9.5表達；同時設(shè)計合成靶向TGF-β1的特異siRNA,并構(gòu)建TGF-β1過表達載體,分別轉(zhuǎn)染活化的人胚肺成纖維細胞WI-38后,Western blot檢測PGP9.5表達結(jié)果：1. TGF-β1刺激能促進人胚肺成纖維細胞WI-38大量表達a-SMA 。2. TGF-β1作用6h時,PGP9.5在活化人胚肺成纖維細胞WI-38的表達就已經(jīng)顯著上調(diào),隨著TGF-β1作用時間的延長,PGP9.5的表達逐漸增加,且差異有顯著性,到24h時,TGF-β1促進活化人胚肺成纖維細胞WI-38表達PGP9.5的效果非常明顯。3.活化人胚肺成纖維細胞WI-38細胞和培養(yǎng)基中PGP9.5的表達趨勢一致：TGF-β1作用12h后,培養(yǎng)基中PGP9.5含量明顯增加,到24h時增加更顯著。4.當(dāng)加入特異靶向TGF-β1的siRNA或其抑制劑LY2109761后,活化人胚肺成纖維細胞WI-38PGP9.5的表達顯著下調(diào)；而轉(zhuǎn)染TGF-β1過表達載體時,其作用和直接加入TGF-β1因子的作用類似,均能顯著增強PGP9.5的表達。5.在轉(zhuǎn)染TGF-β1過表達載體的同時加入TGF-β1的抑制劑LY2109761,雖然與對照組相比,活化人胚肺成纖維細胞WI-38 PGP9.5表達仍然上調(diào),但與TGF-β1過表達載體轉(zhuǎn)染組相比,PGP9.5的表達明顯被下調(diào)。結(jié)論：1. TGF-β1能促進人胚肺成纖維細胞WI-38活化。2. TGF-β1能誘導(dǎo)活化人胚肺成纖維細胞WI-38表達、分泌PGP9.5,并呈時間依賴性。3. TGF-β1 siRNA和其抑制劑LY2109761均能抑制PGP9.5在活化人胚肺成纖維細胞WI-38中的表達。4. TGF-β1過表達同樣能誘導(dǎo)活化人胚肺成纖維細胞WI-38表達PGP9.5。第二部分目的：明確TGF-β1具體通過何種通路調(diào)控PGP9.5在活化人胚肺成纖維細胞WI-38中的表達。方法：設(shè)計合成特異靶向Smad通路關(guān)鍵因子Smad2、Smad3的siRNA,分別轉(zhuǎn)染活化人胚肺成纖維細胞WI-38,另外以ERK1/2、P13K、JNK和p38通路的特異抑制劑,加入活化人胚肺成纖維細胞WI-38中阻斷相對應(yīng)的通路,然后加入TGF-β1刺激,細胞培養(yǎng)48h后用Western blot檢測活化人胚肺成纖維細胞WI-38中PGP9.5表達。結(jié)果：1.靶向Smad2/3的siRNA均可以顯著的抑制TGF-β1促進活化人胚肺成纖維細胞WI-38表達PGP9.5作用。2.相對于TGF-β1作用組, Smad2或Smad3的表達抑制均能顯著降低TGF-β1促PGP9.5表達的作用,不過PGP9.5表達仍然上調(diào)。3.當(dāng)阻斷了ERK1/2和P13K通路后,TGF-β1促PGP9.5表達的效果明顯被降低,PGP9.5表達雖有所上調(diào),但與TGF-β1作用組相比,上調(diào)效果明顯被抑制。4.當(dāng)阻斷JNK和p38通路時,相對于TGF-β1添加組,PGP9.5的表達雖然有所下降,但下調(diào)程度并不十分顯著,PGP9.5仍然表現(xiàn)出比較高的表達。結(jié)論：1.對于活化人胚肺成纖維細胞WI-38,TGF-β1能通過Smad通路調(diào)控PGP9.5的表達。2.對于活化人胚肺成纖維細胞WI-38,TGF-β1還能通過ERK1/2和P13K通路促進PGP9.5表達,而JNK和p38通路在其中的作用并不明顯。第三部分目的：明確TGF-β1誘導(dǎo)活化人胚肺成纖維細胞WI-38表達的PGP9.5是否對結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲能力產(chǎn)生影響。方法：將活化人胚肺成纖維細胞WI-38培養(yǎng)在tran swell小室的上層小室,結(jié)直腸癌細胞培養(yǎng)于下層小室,構(gòu)建共培養(yǎng)模型。當(dāng)活化人胚肺成纖維細胞WI-38加入TGF-β1時, Western blot檢測下層結(jié)直腸癌細胞及其培養(yǎng)基中PGP9.5的表達,MTT實驗檢測結(jié)直腸癌細胞的增殖,流式細胞儀檢測細胞的周期和凋亡,用Transwell侵襲實驗法檢測結(jié)直腸癌細胞侵襲能力變化。結(jié)果：1.隨著TGF-β1作用時間的延長,PGP9.5在下層結(jié)直腸癌細胞培養(yǎng)基中的含量顯著增多。2.隨著TGF-β1濃度的增加,細胞的增殖逐步明顯增強。當(dāng)活化人胚肺成纖維細胞WI-38加入TGF-β1的同時,往結(jié)直腸癌細胞中加入PGP9.5抑制劑,此時細胞的增殖相對于對照組仍然增加,但相對于單純TGF-β1添加組,其增殖率明顯被降低。3.當(dāng)加入TGF-β1到活化人胚肺成纖維細胞WI-38后,結(jié)直腸癌細胞凋亡峰(Sub β1峰)的比例顯著降低；往結(jié)直腸癌細胞中加入TGF-β1的抑制劑時,與對照組比較,Sub G1峰的比例也下降,不過比TGF-β1添加組高。類似的,在結(jié)直腸癌細胞中加入PGP9.5的抑制劑時,Sub G1峰的比例相對于對照組也發(fā)生下調(diào),但仍然比TGF-β1添加組高。4.活化人胚肺成纖維細胞WI-38加入TGF-β1后,結(jié)直腸癌細胞的侵襲能力顯著增加。而當(dāng)活化人胚肺成纖維細胞WI-38加入TGF-β1的同時,往結(jié)直腸癌細胞中加入PGP9.5抑制劑后,此時細胞的侵襲能力相對于對照組仍然增加,但相對于單純TGF-β1添加組,其侵襲能力明顯被抑制。結(jié)論：1. TGF-β1誘導(dǎo)活化人胚肺成纖維細胞WI-38表達的PGP9.5能促進結(jié)直腸癌細胞的增殖,當(dāng)PGP9.5被抑制時,TGF-β1進一步活化人胚肺成纖維細胞WI-38而促進結(jié)直腸癌細胞增殖的作用被明顯抑制。2.在TGF-β1作用活化人胚肺成纖維細胞WI-38而抑制結(jié)直腸癌細胞凋亡的過程中,PGP9.5發(fā)揮了作用,但抑制PGP9.5的作用也未能完全阻斷TGF-β1作用活化人胚肺成纖維細胞WI-38后對腫瘤細胞的影響,TGF-β1作用活化人胚肺成纖維細胞WI-38后還有可能分泌其他因子而發(fā)揮作用。3. TGF-β1作用活化人胚肺成纖維細胞WI-38后能顯著促進腫瘤細胞的侵襲,而PGP9.5在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。抑制PGP9.5的作用后,TGF-β1作用活化人胚肺成纖維細胞WI-38而促進結(jié)直腸癌細胞侵襲的作用在一定程度上被阻斷。實驗研究結(jié)論：1、TGF-β1能誘導(dǎo)活化人胚肺成纖維細胞WI-38分泌表達PGP9.5并呈時間依賴性。2、TGF-β1主要通過Smad、ERK1/2和P13K通路調(diào)控活化人胚肺成纖維細胞WI-38中PGP9.5的表達。3、TGF-β1誘導(dǎo)活化人胚肺成纖維細胞WI-38表達的PGP9.5能促進結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲,并抑制結(jié)直腸癌細胞的凋亡。
[Abstract]:In recent years , there has been a growing trend in the development of tumor cells , especially in developed rural areas and cities . In the course of tumor growth , PGP9.5 exhibits a key role in the development of colorectal cancer . In this study , PGP9.5 exhibits a key role in the development of colorectal cancer . After transfection of activated human embryonic lung fibroblasts ( WI - 38 ) , the expression of PGP9.5 was detected by Western blot : 1 . TGF - 尾1 stimulated the expression of a - SMA in human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . The expression of PGP9.5 in activated human embryonic lung fibroblasts WI - 38 cells and medium was significantly lower than that of control group . TGF - 尾1 can promote the activation of human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . TGF - 尾1 could induce the expression of WI - 38 in human embryonic lung fibroblasts , secrete PGP9.5 and time - dependent . TGF - 尾1 siRNA and its inhibitor LY2109761 can inhibit the expression of PGP9.5 in activated human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . The results showed that TGF - 尾1 stimulated the expression of PGP9.5 in human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . The results showed that TGF - 尾1 could significantly inhibit the expression of PGP9.5 in activated human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . When the inhibitor of TGF - 尾1 was added to colorectal cancer cells , the proportion of the sub G1 peak was also decreased compared with the control group , but the proportion of the sub G1 peak was lower than that in the control group . TGF - 尾1 can promote the proliferation of colorectal cancer cells . TGF - 尾1 plays a role in inhibiting the proliferation of colorectal cancer cells when PGP9.5 is inhibited , but also inhibits the effect of TGF - 尾1 on tumor cells after activation of human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . TGF - 尾1 also plays a role in inhibiting the proliferation of human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . TGF - 尾1 also plays a role in inhibiting the proliferation of human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . TGF - 尾1 plays a key role in promoting the invasion of human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . TGF - 尾1 can induce the expression of PGP9.5 in human embryonic lung fibroblasts WI - 38 . TGF - 尾1 can induce the proliferation , invasion and apoptosis of colorectal cancer cells .

【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

【參考文獻】

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本文編號：1530738