本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 化療敏感性 miR-136 重樓皂苷D　出處：《武漢大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腦膠質(zhì)瘤是一種發(fā)病率和死亡率都比較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,雖然可以通過手術(shù)治療切除,但其術(shù)后的復(fù)發(fā)率仍然非常高。為了提高治療效果,目前臨床上常規(guī)采用手術(shù)后聯(lián)合放化療為主的綜合治療措施,即便如此,膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然不佳。當(dāng)今臨床治療中面臨的挑戰(zhàn)主要為：腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制不是非常清楚,并且腫瘤藥物在治療抗癌過程中的耐藥現(xiàn)象比較普遍,另外現(xiàn)有的可以使用且安全可靠的抗癌藥物種類不多。因此,為了進(jìn)一步探索腦膠質(zhì)瘤的相關(guān)作用機(jī)制及代謝通路,同時為膠質(zhì)瘤的治療提供新的方法和思路,我們進(jìn)行了如下的研究：本實(shí)驗(yàn)以微小RNA(micro-RNA)作為研究核心,發(fā)現(xiàn)miR-136具有明顯的抑癌作用,并且我們通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明其對腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)功能影響,進(jìn)一步,我們探索研究miR-136下游可能的作用靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)miR-136對下游靶基因E2F1有抑制作用,并具有調(diào)控E2F1的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的作用。最后,我們通過體外實(shí)驗(yàn)選擇并研究了一種新穎的源自植物的單體化合物重樓皂苷D(polyphllin D, PD),該化合物對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用,通過觀察該藥物作用膠質(zhì)瘤細(xì)胞時miR-136的表達(dá)水平的變化從而為miR-136的臨床應(yīng)用提供了可能的依據(jù)。第一部分：miR-136對膠質(zhì)瘤的生物學(xué)影響目的：研究miR-136與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系,以及對膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。方法：本文通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)(qRT-PCR)對人膠質(zhì)瘤組織中的miR-136表達(dá)水平進(jìn)行檢測統(tǒng)計(jì),并研究miR-136與腫瘤病理分級之間的關(guān)系。進(jìn)一步,利用qRT-PCR技術(shù)觀察miR-136在各種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系細(xì)胞及正常細(xì)胞系中的表達(dá)情況。其次通過藥物篩選培養(yǎng)方法獲得膠質(zhì)瘤耐順鉑細(xì)胞株U251 (U251-CDDP),然后將其與野生型U251細(xì)胞株作為對照。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)加入miR-136模擬物(miR-136 mimics),用MTS法觀察比較上述兩種細(xì)胞系中miR-136低表達(dá)及miR-136高表達(dá)細(xì)胞系的IC50值,并繪制出細(xì)胞增殖抑制率曲線。通過劃痕實(shí)驗(yàn)、Trans-well體外侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)等方法觀察miR-136表達(dá)水平對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力的影響。最后,用流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同miR-136表達(dá)水平情況下膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的差異和膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期的改變。從而得出miR-136高表達(dá)組與miR-136低表達(dá)組在細(xì)胞生長、侵襲,凋亡,細(xì)胞周期等方面變化情況差異。結(jié)果：1、miR-136表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度成負(fù)相關(guān)。2、我們成功篩選和培養(yǎng)出對順鉑(cisplatinum)耐藥的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株并命名為U251-CDDP。3、miR-136轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,與低表達(dá)組相比,miR-136高表達(dá)組在U251腫瘤細(xì)胞及U251-CDDP中均表現(xiàn)為明顯的抑癌作用,如抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞遷移及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡等作用。結(jié)論：1.miR-136具有抑癌基因的特點(diǎn),其表達(dá)水平可以作為一項(xiàng)提示腫瘤惡性程度的重要指標(biāo)2.miR-136具有能抑制U251細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。3 miR-136具有能夠提高膠質(zhì)瘤耐順鉑細(xì)胞株U251-CDDP對于化療藥物敏感性的能力。第二部分：miR-136可以通過下游靶基因E2F1發(fā)揮生物學(xué)作用目的：尋求miR-136可能的的靶點(diǎn)基因,證明這些靶基因與miR-136之間的相互作用關(guān)系,以及這種下游靶基因的基本生物學(xué)功能。方法：通過多個基因信息檢索網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-136可能的作用靶基因E2F1,并據(jù)此設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物,通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測并驗(yàn)證E2F1與miR-136的關(guān)系。研究E2F1表達(dá)與腫瘤的惡性程度的相關(guān)性,通過增加E2F1或阻斷E2F1表達(dá)的方法來研究E2F1表達(dá)變化前后細(xì)胞的生物學(xué)功能變化。具體包括利用MTS測定E2F1表達(dá)水平的改變對耐順鉑膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251-CDDP)的半數(shù)致死率(IC50)變化情況的影響,利用Trans-well實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和Western Blot等方法檢測E2F1對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲,凋亡和細(xì)胞周期的影響。結(jié)果：miR-136可以抑制其下游靶基因E2F1的表達(dá)。E2F1的表達(dá)和腫瘤的惡性程度成正相關(guān)。通過阻止E2F1的表達(dá)(siRNA-E2F1)可以使耐藥腫瘤細(xì)胞的IC50下降,侵襲程度減少,抑制細(xì)增殖,促進(jìn)凋亡,這些作用與miR-136的生物學(xué)功能類似,而轉(zhuǎn)染E2F1后上述的這些生物學(xué)作用受到抑制。結(jié)論：miR-136與E2F1的關(guān)系密切且E2F1具有與miR-136相反的生物學(xué)功能,這些促癌生物學(xué)功能可以通過miR-136對E2F1的直接調(diào)控而被抑制。因此,我們的實(shí)驗(yàn)證明miR-136通過直接調(diào)節(jié)其下游靶基因E2F1來實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能。第三部分：miR-136與抗腫瘤藥物重樓皂苷D (polyphllin D)的關(guān)系目的：通過闡明新穎的單體化合物重樓皂苷D (polyphllin D, PD)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用及miR-136表達(dá)水平的影響,研究miR-136與PD的聯(lián)系。并為實(shí)現(xiàn)miR-136的臨床應(yīng)用及更好的治療腦膠質(zhì)瘤提供新的思路和幫助。方法：我們選擇重樓皂苷D作用于U87細(xì)胞后通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況,利用及流式儀檢測了PD細(xì)胞凋亡的影響,利用western-blot實(shí)驗(yàn)檢測了相關(guān)的凋亡蛋白,研究了可能的細(xì)胞通路。另外使用qRT-PCR技術(shù)測定U87細(xì)胞在PD作用后其miR-136的表達(dá)情況改變。結(jié)果：PD能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡,導(dǎo)致抗凋亡相關(guān)蛋白BCL-2及BAX表達(dá)下降,促凋亡蛋白caspase-3表達(dá)上升,進(jìn)一步,通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)PD干預(yù)處理后miR-136的表達(dá)相對升高,結(jié)論：PD具有誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用,且這種作用可能是通過miR-136的上調(diào)并作用相關(guān)下游靶基因獲得的。因此,PD在實(shí)際臨床運(yùn)用中或許能起到類似于miR-136模擬物mimics的作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of miR - 136 on the biological function of glioma cells by observing the relationship between miR - 136 and pathological grade of glioma . Conclusion : miR - 136 can inhibit the proliferation of tumor cells , decrease the invasion degree , inhibit the proliferation of tumor cells and promote apoptosis . By qRT - PCR , we found that the expression of miR - 136 was relatively high after PD intervention , and it was concluded that PD had the effect of inducing apoptosis of glioma cells , and this effect could be obtained by the up - regulation of miR - 136 and the effect of the relevant downstream target gene . Therefore , PD might play a role similar to miR - 136 simulants in actual clinical use .

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1526851