本文關(guān)鍵詞： 乳腺癌 蛋白質(zhì)組學(xué) 類載脂蛋白C-I　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤,在過去的10年間,乳腺癌在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率逐步上升,雖然大部分為絕經(jīng)后患者,但仍有15%-26%的患者為絕經(jīng)前患者,其中40歲以下的患者大約占7%。中國乳腺癌人群的發(fā)病年齡與歐美國家不同,相當(dāng)數(shù)量的絕經(jīng)前女性被診斷出乳腺癌,這類人群往往在生活角色和社會角色的扮演上更為重要,因此早期發(fā)現(xiàn)以爭取獲得治愈的機(jī)會對患者來說尤為重要。如果可以找到敏感性高、特異性高并且可以用于早期診斷和篩查的生物指標(biāo),就能夠早期發(fā)現(xiàn)尚處于亞臨床階段的病變。蛋白質(zhì)血清標(biāo)記物在乳腺癌診療中有一定的參考價值,因其創(chuàng)傷性小、敏感度高在乳腺癌早期診斷領(lǐng)域有著更廣闊的發(fā)展空間。相比于基因,蛋白質(zhì)是復(fù)雜生命現(xiàn)象及病理狀態(tài)的真實(shí)體現(xiàn)者,更能直接地反映機(jī)體生理及病理過程的變化。不僅可以反映蛋白質(zhì)水平的變化,而且可以反映蛋白質(zhì)翻譯和修飾后水平的變化,其敏感性和準(zhǔn)確性都相對較高,而且隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展,通過檢測血清中的差異蛋白質(zhì)來發(fā)現(xiàn)新的乳腺癌生物標(biāo)記物逐步成為一種成熟的技術(shù)。SELDI-TOF-MS蛋白芯片技術(shù)就是對腫瘤患者和健康對照人群的血清或組織標(biāo)本進(jìn)行差異蛋白質(zhì)譜的比較,找出該腫瘤特異的蛋白質(zhì),可以早期和動態(tài)地檢測疾病的發(fā)生發(fā)展,更加敏感、精確、有效。本研究按上述思路,通過收集乳腺癌患者和正常健康女性的血清標(biāo)本,應(yīng)用表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜(seldi-tof-ms)技術(shù),分別研究了乳腺癌術(shù)前組與健康人群組、乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組、非三陰性乳腺癌組與三陰性乳腺癌組的血清樣本,找出各組蛋白質(zhì)譜的變化特征,進(jìn)而探求腫瘤特異性血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物,為乳腺癌的早期診斷、不同亞型的治療策略及預(yù)后分析提供相應(yīng)的幫助。然后聯(lián)合maldi-tof-ms、tricine-sds-page和westernblot等多種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對篩選出的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行相關(guān)鑒定和驗(yàn)證,再進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)研究,觀察其對荷瘤小鼠瘤體生長的影響,然后進(jìn)一步對比實(shí)驗(yàn)組和對照組樣本免疫組化結(jié)果,了解該目標(biāo)蛋白質(zhì)肽段的生物學(xué)功能,觀察其對乳腺癌的影響。研究目的應(yīng)用seldi-tof-ms技術(shù)對比乳腺癌術(shù)前組與健康人群對照組、乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組、三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組之間的血清蛋白質(zhì)譜變化特征,篩選出差異性蛋白質(zhì)峰,建立與乳腺癌早期診斷、病理分型、分子分型、療效評價、預(yù)后評估直接相關(guān)的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。并對篩選鑒定出的目標(biāo)蛋白進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞株和動物學(xué)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步了解其生物學(xué)特性,探索其在乳腺癌治療中的作用,為臨床上乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、治療、及尋找新藥靶點(diǎn)提供可行的方法。材料與方法1材料血清樣本收集與處理,收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院女性乳腺癌患者資料總計(jì)60例,時間自2011年6月至2014年6月,其年齡范圍為23-70歲,平均年齡為46.7+0.4歲,病理診斷確診為乳腺癌,所有患者入組前均未接受任何治療,診斷明確后接受規(guī)范化手術(shù)治療,術(shù)后接受化療、放療、靶向治療及內(nèi)分泌治療等。其中確診為三陰性乳腺癌的病例數(shù)為22例。同時收集健康女性的血清樣本20例,作為健康對照組。所有參與實(shí)驗(yàn)的患者及健康對照者,都已了解相關(guān)內(nèi)容,并征得知情同意。連續(xù)收集入組乳腺癌術(shù)前、對應(yīng)術(shù)后2周的標(biāo)本,兩組均為60例、60例。所有患者均在清晨06:30~07:30抽血留取血清標(biāo)本,均為空腹,室溫下放置時間為0.5-1h,然后將標(biāo)本放入離心機(jī)離心20-30min,參數(shù)設(shè)置為3000r/min,離心后標(biāo)本抽取上清液,放至ep管,分別編號標(biāo)記,放入-80℃冰箱保存待用。2主要試劑與儀器seldi-tof-ms、96孔蛋白芯片(bioprocessor)、seldi芯片、wcx芯片、chaps(3-環(huán)乙胺-1-丙磺酸)、乙腈(acetonitrile),dtt(1,4-二硫代蘇糖醇)、temed(四甲基乙二胺)均購于美國ciphergen公司,maldi-tof-ms購于英國kratosanalytical公司,真空冷卻離心濃縮系統(tǒng)(spdspeedvac)購于美國thermoelectroninc公司,胰蛋白酶(trypsase)于美國promegainc公司。類載脂蛋白c-i肽段由中國澤溪源生物科技有限公司合成。3方法3.1乳腺癌血清中特異性蛋白質(zhì)的篩選將預(yù)先收集并標(biāo)記好的血清標(biāo)本解凍,用弱陽離子(wcx)磁珠處理樣本,并向處理好的樣品中添加基質(zhì),將制備好的樣本分別點(diǎn)在蛋白質(zhì)芯片板上,然后對讀片操作程序進(jìn)行編輯,設(shè)置參數(shù)如下:分子量范圍2000da-20000da,最高分子量30000da,并檢測儀器的運(yùn)行情況及其靈敏度,然后把裝有檢測樣本的蛋白質(zhì)芯片板放置于質(zhì)譜儀中,通過seldi-tof-ms系統(tǒng),進(jìn)行數(shù)據(jù)收集,并應(yīng)用相應(yīng)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,分別獲取到樣本的m/z峰(質(zhì)/荷比),數(shù)據(jù)中差異性0.3%的被認(rèn)為是同一種蛋白質(zhì)。然后對收集到的樣本結(jié)果,進(jìn)行wilcoxon秩和檢驗(yàn),觀察兩組數(shù)據(jù)的p值,p值越小,其代表兩組之間的差異強(qiáng)度就越大,也越有研究意義,從而篩選出差異明顯的蛋白質(zhì)。3.2乳腺癌血清中特異性蛋白質(zhì)的鑒定與驗(yàn)證對樣本進(jìn)行篩選后,開始制備凝膠,收集乳腺癌組樣品血清2ml,然后加入超純水,稀釋至5ml,再進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(tricine-sds-page)分離,分離結(jié)束后進(jìn)行切膠操作,然后把得到樣本分裝至不同的ep管中并標(biāo)記,參照膠內(nèi)酶解試劑盒的說明書,經(jīng)酶解得到目標(biāo)蛋白。向樣本中加入提取液,然后對上清液進(jìn)行提取,將基質(zhì)添加至上清液后,在蛋白質(zhì)芯片板上進(jìn)行點(diǎn)樣,然后放入maldi-tof-ms中,經(jīng)過激光轟擊,肽段序列進(jìn)行收集,然后利用mascot軟件,繼而與swissprot數(shù)據(jù)庫連接、進(jìn)行匹配和比對,最終得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。進(jìn)而用westernblot對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。3.3類載脂蛋白c-i肽段對乳腺癌細(xì)胞株體內(nèi)外影響及生物學(xué)特性研究根據(jù)目標(biāo)蛋白的氨基酸序列合成肽段,研究肽段對乳腺癌細(xì)胞株的影響及對乳腺癌細(xì)胞株荷瘤小鼠瘤體的影響,同時對瘤體進(jìn)行免疫組化檢測,進(jìn)一步了解這一目標(biāo)蛋白在乳腺癌中的生物學(xué)特性及臨床意義。結(jié)果1乳腺癌差異性蛋白峰的檢測1.1乳腺癌術(shù)前組與健康對照組之間的比較將兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,包括對數(shù)據(jù)去噪、進(jìn)行基線減除和聚類分析,然后經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理,得到各自的蛋白質(zhì)峰值,通過wilcoxon秩和檢驗(yàn)的方法,共發(fā)現(xiàn)到14個差異蛋白峰(p0.01)。其中有11個在乳腺癌組呈高表達(dá),3個在乳腺癌組呈低表達(dá)。運(yùn)用svm回歸方法,對樣本中youden指數(shù)最高的模型進(jìn)行篩選,最終得到m/z峰位于6447.9的蛋白質(zhì)肽段。其在乳腺癌組低表達(dá)強(qiáng)度為38.0187±34.2194,而在健康對照組呈高表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度為337.5261±207.6438,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。1.2乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組之間的比較對乳腺癌術(shù)前組與術(shù)后組進(jìn)行分析,共發(fā)現(xiàn)6個差異性蛋白質(zhì)峰值(p0.01),其中有4個在乳腺癌術(shù)前組高呈表達(dá),有2個低表達(dá)。使用svm回歸方法,從樣本中篩選出youden指數(shù)最高的模型,最終也得到m/z峰位于6447.9的蛋白標(biāo)記物,其在術(shù)前組表達(dá)強(qiáng)度為38.0187±34.2194,術(shù)后組表達(dá)強(qiáng)度為294.1245±102.8634,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。1.3三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組之間的比較對三陰性乳腺組與非三陰性乳腺癌組進(jìn)行分析比較,從而篩選差異性的蛋白質(zhì)峰值(p0.01),共篩選出9個,其中有4個在三陰性乳腺癌組低表達(dá),5個呈高表達(dá)。使用svm回歸方法,從樣本中挑選出youden指數(shù)最高的模型,也可以得到m/z峰位于6447.9的蛋白標(biāo)記物,其中在三陰性乳腺癌中表達(dá)強(qiáng)度為5.1351+3.6437,非三陰性乳腺癌組表達(dá)強(qiáng)度43.6162±18.8542,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。2目標(biāo)蛋白質(zhì)的鑒定與驗(yàn)證對篩選出的蛋白質(zhì)肽段進(jìn)行分離、純化,使用maldi-tof-ms技術(shù)對前期所得到的肽段進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示:m/z峰位于6447.9的蛋白質(zhì)經(jīng)過鑒定為類載脂蛋白c-i(apoc-i)。然后使用westernblot的方法對鑒定出的目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。3類載脂蛋白c-i肽段對乳腺癌細(xì)胞株體內(nèi)外影響及生物學(xué)特性研究3.1類apoc-i肽段對乳腺癌細(xì)胞株有殺傷作用隨著肽段濃度的升高,24h、48h、72h、96h、120h后肽段對乳腺癌細(xì)胞株mcf-7、mda-mb-231殺傷作用逐漸增強(qiáng)。3.2類apoc-i肽段對乳腺癌荷瘤小鼠瘤體生長具有抑制作用對裸鼠接種mcf-7腫瘤細(xì)胞成功后分為對照組(生理鹽水),實(shí)驗(yàn)組(肽段),連續(xù)尾靜脈給藥,給藥組裸鼠瘤體生長速度慢于對照組,瘤體的體積大小和重量也具有差異性,同時裸鼠生命體征平穩(wěn),未出現(xiàn)死亡等不良反應(yīng),可見肽段毒副作用小,并且效果顯著。3.3對照組和實(shí)驗(yàn)組瘤體免疫組化結(jié)果對照組中pcna,ki67,bcl-2表達(dá)量明顯增高,bax表達(dá)量降低,實(shí)驗(yàn)組中pcna,ki67,bcl-2表達(dá)量明顯降低,bax表達(dá)量上調(diào),同時可見腫瘤壞死區(qū)。結(jié)論通過本研究證實(shí)了質(zhì)荷比(m/z)為6447.9的蛋白質(zhì)為類載脂蛋白c-i(ApoC-I),這種蛋白質(zhì)肽段在乳腺癌術(shù)前組和對照組、乳腺癌術(shù)前組和術(shù)后組、三陰性組和非三陰性組的血清樣本中表達(dá)量均有差異,可做為乳腺癌特異性血清蛋白標(biāo)記物,與臨床常用的乳腺癌腫瘤標(biāo)記物如CA-153和CEA聯(lián)合用于提高對乳腺癌早期診斷、手術(shù)療效評估。我們的研究還發(fā)現(xiàn)類ApoC-I肽段對乳腺癌細(xì)胞株具有殺傷作用,是一種新型的蛋白類抗腫瘤藥,可能成為乳腺癌治療的新型靶向藥物,也可能在其他類型的腫瘤中發(fā)揮作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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5 辛s，

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