發(fā)布時間：2018-02-17 02:54

  本文關鍵詞： 肝癌 CD200受體 巨噬細胞膠原結構受體 共抑制性受體 清道夫受體　出處：《中國科學技術大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：肝臟是人體中最大的實體器官。肝臟過濾來源于血液中的有害物質,儲存肝糖原作為能源,產生膽汁和消化脂肪,是重要的代謝器官。目前肝臟也被認為是人體中的免疫器官之一,它具有許多獨特的免疫學特性,可以執(zhí)行許多重要的免疫功能。肝臟獨特的免疫功能與它的結構是密不可分的。除了局部免疫反應外,肝臟也可以調節(jié)全身固有免疫反應,在對抗病原體,寄生蟲及惡性腫瘤細胞中起到了重要的作用。肝臟主要由肝細胞組成,同時含有大量的NK細胞,NKT細胞及巨噬細胞。肝臟中含有最大的駐留巨噬細胞群(枯否細胞),占到了人體中所有組織巨噬細胞的80-90%。另外,肝臟中還含有大量浸潤單核細胞／巨噬細胞,特別是在肝損傷及感染時可以大幅增加巨噬細胞向肝臟的遷移與定居。成人原發(fā)性肝細胞癌(HCC,包括肝癌和膽管癌)是全世界癌癥相關死亡的第二大原因。肝癌構成了肝臟中大部分的惡心腫瘤,它一般是由常見的臨床風險因素所致,包括慢性乙肝病毒和丙肝病毒感染,大量酒精攝入,脂肪性肝炎,和糖尿病。大多數的肝癌都是由慢性乙肝病毒及丙肝病毒感染所致,慢性病毒感染會發(fā)展成為持續(xù)性的炎癥,導致纖維化／肝硬化伴隨著大量的淋巴細胞浸潤。腫瘤內不同類型細胞和其基質之間的cross-talk通常會誘導腫瘤的發(fā)展。目前,肝癌切除術仍然是治療肝癌最有效的療法之一。由于較高的復發(fā)率,肝癌患者的整體術后存活率仍然不能令人滿意。為了研究巨噬細胞與肝癌發(fā)生發(fā)展的關系并尋找可能的免疫預測方法,本論文開展了如下研究。Ⅰ. 抑制性受體CD200R的表達與肝癌預后密切相關免疫系統(tǒng)有自己的方法來平衡其免疫反應及免疫耐受。一方面,免疫系統(tǒng)識別并且清除表達外來抗原的腫瘤細胞,而另一方面,它通過免疫耐受機制精細控制對于表達自身抗原的細胞的攻擊。同時,腫瘤細胞通過“免疫編輯”并利用免疫系統(tǒng)的免疫耐受機制逃避免疫攻擊。免疫逃逸的基本機制已被廣泛研究,其中之一是通過操控細胞活化后表達的免疫調控分子。一般認為,在癌癥的發(fā)展過程中,免疫細胞會被耗盡并且其功能降低,使得腫瘤細胞更容易逃逸免疫應答。免疫細胞的耗盡通常伴隨著共抑制分子的高表達,對這些負調分子的操控可以很好的恢復免疫應答,從而起到對抗腫瘤細胞的作用。抑制性CD200:CD200R軸對于早期微生物感染時防止炎癥反應和免疫病理至關重要。在幾種腫瘤模型中都已經驗證了CD200的表達與癌癥的發(fā)展是密切相關的,且阻斷這條通路可以恢復抗腫瘤的免疫應答。CD200廣泛表達于多種細胞類型,包括實體瘤和惡性血液瘤,而它的受體CD200R,主要表達在髓系來源和淋巴系來源的免疫細胞上。CD200-CD200R軸似乎有助于腫瘤細胞逃逸以及對免疫應答的抑制。由于CD200-CD200R軸在不同的腫瘤模型中都抑制了免疫應答,并且不同程度直接或者間接的干擾了免疫細胞的活動,我們因此探究了CD200-CD200R軸與肝癌之間的相關性。在我們的研究中我們發(fā)現肝癌患者中CD200及CD200R的表達明顯高于正常人。我們觀察到CD200R主要表達在巨噬細胞上而CD200廣泛分布于各種肝細胞及肝癌細胞上。癌周基質(peritumoural stroma)也被稱為invasive margin,它連接了腫瘤的中心區(qū)域與腫瘤的遠端區(qū)域。腫瘤中不同類型的細胞與其基質之間的cross-talk現在被公認為腫瘤發(fā)展的因素之一。癌周基質有大量的白細胞浸潤,因此很容易就可以在顯微鏡下識別。CD200R主要表達在癌周基質區(qū)域,提示了CD200R在抑制這些CD200R+浸潤白細胞中的作用。除了免疫組化染色觀察,IOD/area的值也用于代表肝癌患者中CD200R的表達量。較高的IOD/area意味著更高的表達,反之亦然。CD200R的IOD/area與肝癌患者的腫瘤直徑以及AFP都成正相關,并且晚期肝癌患者及丟失了腫瘤包膜的肝癌患者的癌周基質中的CD200R的表達遠遠高于早期肝癌患者及腫瘤包膜完整患者,這些都表明了CD200R的表達隨著腫瘤的發(fā)展而累積,并且可以作為探測腫瘤發(fā)展的潛在標志物。雖然癌癥患者的免疫抑制狀態(tài)眾所周知,大量的證據表明,在腫瘤局部發(fā)生的炎癥反應同樣可以促進腫瘤的生長和發(fā)展。肝癌通常由伴隨著廣泛白細胞浸潤的肝硬化誘導而來。在這些浸潤的白細胞當中,巨噬細胞來源的枯否細胞通常集中在癌周基質,而在腫瘤中心只有很少的巨噬細胞存在。通過在連續(xù)切片上對CD8,CD57和CD68進行免疫組化染色,我們再次證實了肝癌組織中大量CD68+細胞的存在。此外,大多數CD200R+細胞與CD68+細胞共定位,證實了在這種特殊狀態(tài)下CD68+巨噬細胞上CD200R的表達。值得注意的是,肝癌與其他惡性腫瘤不同,肝癌的預后不僅僅取決于腫瘤的分期,還取決于伴隨著的肝硬化引起的功能障礙。因此,我們進一步研究了CD200R在肝損傷中的作用。CD200R高表達患者和CD200R低表達患者之間AST水平的比較表明CD200R高表達的患者的血液中的AST表達也更高。肝癌患者通常伴有較高的腫瘤復發(fā)率和轉移率,可以預測肝癌復發(fā)和轉移的潛在生物標志物的探索顯得尤為重要。在我們的研究中,我們發(fā)現CD200R高表達患者的總體生存率和無復發(fā)生存率都要遠遠低于CD200R低表達患者,預示了CD200R作為一個可預測肝癌預后復發(fā)及生存的指標的可能性。我們的研究結果提示過強的CD200R信號通路可導致免疫耐受以抑制肝癌患者中的免疫功能。同時,也預示阻斷這條信號通路可以逆轉腫瘤的免疫逃逸以恢復抗腫瘤免疫應答,提示了CD200R在提高免疫治療功效中潛在的作用。另一方面,CD200R信號通路不僅可以抑制免疫應答,它同時也會抑制促進腫瘤的炎癥反應。對CD200-CD200R相互作用的阻斷增強了抗腫瘤反應的同時也增強了促進腫瘤的炎癥反應,這樣的炎癥反應最終也將導致肝癌的發(fā)展。因此,當用CD200R作為checkpoint來進行阻斷的同時其促進炎癥的這一方面也不容忽視。我們需要找到其中的平衡才能更好的使用它為臨床作出貢獻�？偠灾�,我們首次證明了癌周基質中CD200R的表達可以作為潛在的指標預測肝癌的發(fā)展和預后。CD200R高表達患者有可能伴隨更為嚴重的惡性腫瘤,更高的復發(fā)率和更低的生存率。因為目前針對肝癌治療的方法是非常有限的,CD200R可以被認為是一個治療肝癌的潛在治療靶點。然而,詳細的機制需要進一步的研究,更多更全面的研究才能使我們到達這一目的。Ⅱ. MARCO氐表達與肝癌病程發(fā)展及患者生存預后密切相關天然免疫細胞可以通過包括清道夫受體(SR)等一系列的模式識別受體,來對外界抗原及病原體進行免疫識別。巨噬細胞膠原結構受體(MARCO)來自于A類清道夫受體家族,其具體的特征是胞外段存在膠原和富含半胱氨酸的結構域。兩種受體均在巨噬細胞和樹突狀細胞上表達,其功能是在多種細胞上作為分子傳感器,同時作為吞噬受體與各種微生物組分進行結合。然而,一些研究線索表明,清道夫受體除了模式識別和吞噬清除的功能外,還存在其他的潛在功能。MARCO表達于非常特定的巨噬細胞亞群,其表達會在機體發(fā)生細菌感染后在炎癥部位大量提升。這些特性提示我們,MARCO除了模式識別和吞噬清除的功能外,還發(fā)揮調節(jié)免疫炎癥和免疫應答的潛在功能。目前針對MARCO研究還始終缺乏系統(tǒng)深入的工作,尤其是對于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,MARCO的表達與發(fā)揮作用幾乎沒有相應研究,導致對于此方面的知識還存在空白。我們通過文獻調研發(fā)現,針對肝癌樣品大規(guī)模RNA測序和比較肝癌原發(fā)病灶組織和癌旁健康組織之間的差異表達基因,MARCO表達存在顯著性的差異,是差異表達最顯著的前30個基因之一。同時,肝臟富含巨噬細胞,是MARCO表達的主要細胞。這些前人的發(fā)現提示我們,MARCO在肝癌微環(huán)境中是否發(fā)揮著重要的作用?MARCO能否作為肝癌及其相關疾病的預后指標?人類和小鼠的肝臟中均含有豐富的天然免疫淋巴細胞,如NK細胞,NKT細胞和枯否細胞。鑒于現有的證據表明,MARCO在巨噬細胞上高表達,我們進一步檢測了MARCO在肝臟中的可能發(fā)揮的潛在角色。有趣的是,公開基因表達數據庫(Oncomine, www.oncomine.org)中表明,在正常肝組織MARCO的mRNA表達比在HCC顯著升高。在我們的研究中發(fā)現,通過免疫組化染色檢測MARCO在肝癌組織中的表達水平,將IOD/area做為MARCO蛋白表達的量度。較高的IOD/area意味著更高的表達,反之則意味著MARCO表達降低。與基因表達數據庫的結果一致,在我們的肝癌組織和癌旁組織樣品中,無論是蛋白質水平和mRNA的表達水平,MARCO在腫瘤內組織顯著低于癌旁正常組織,提示MARCO在肝癌組織微環(huán)境中,發(fā)揮著重要作用。此外,我們的研究結果顯示,MARCO在健康志愿者的肝臟中的表達水平最高,其次是肝硬化患者,肝癌患者,肝癌轉移患者,而這又與基因數據庫的結論相統(tǒng)一。我們還進一步發(fā)現,在腫瘤周圍間質區(qū)域和癌組織之間,MARCO表達會形成很明顯的一條清晰邊界,在癌內MARCO表達明顯的低于癌旁的組織。健康對照組的MARCO表達顯著性高于肝癌患者和肝癌轉移患者,MARCO的表達隨著肝癌病情的加重,會在肝臟組織中逐漸降低。通過進一步的分析,我們發(fā)現MARCO表達水平不僅會伴隨著疾病的進程而越來越低,MARCO的表達與腫瘤的分期進展密切相關。結果發(fā)現,處在TNM早期患者的肝臟組織中MARCO表達水平顯著高于處在TNM晚期的患者,而且在有明顯腫瘤包膜的患者體內MARCO表達也會顯著高于沒有腫瘤包膜的患者,這兩個參數通常都與腫瘤的嚴重性密切相關。這些數據表明,MARCO表達水平會沿著疾病進程和腫瘤進展,而逐漸減少減低,提示我們在預測肝癌相關疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,MARCO存在作為腫瘤預后標志物的潛能。盡管癌旁組織與癌組織比較,往往會被認為是“相對正�！苯M織,然而癌旁組織在鏡下觀察,也會存在不同程度的炎癥反應�？莘窦毎歉闻K駐留的巨噬細胞,其與肝臟內的炎癥反應密切相關。在識別外來抗原方面,枯否細胞可以被活化并釋放多種炎癥介質,包括多種細胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-6),趨化因子(單核細胞趨化蛋白-1,MCP-1),巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1α,MIP-1β和RANTES等。我們的結果中通過激光共聚焦檢測發(fā)現,CD68+巨噬細胞標記和MARCO+標記會共定位在同一細胞上,證實在肝癌組織中MARCO的表達主要是在枯否細胞上表達。腫瘤復發(fā)和轉移,可以嚴重影響術后生活質量和術后存活率。在我們的研究中發(fā)現,MARCO的表達與患者術后的生存預后密切相關,肝癌組織中高表達MARCO的患者會伴隨著更久的生存周期時間,這些結果提示MARCO在HCC患者中具有預測生存預后的價值。終上所述,本研究工作首次闡明了MARCO和肝癌之間的相互關系。尤其是我們的結果表明,患者的肝癌組織內低表達MARCO,會伴隨著更差的疾病預后和生存周期下降。在本研究工作中,我們提供了充分的證據表明MARCO在肝癌病人中發(fā)揮著重要角色,這些發(fā)現之前都沒有被研究和報道過。然而,MARCO在肝癌患者中低表達是否是疾病惡化的原因或只是其預后不良的結果仍存在不清楚的地方。一方面,鑒于MARCO主要表達于巨噬細胞,但駐留在肝癌腫瘤組織中的巨噬細胞較少,所以檢測到的MARCO表達強度降低可能是由于在肝癌組織中的巨噬細胞表達減少導致。另一方面,MARCO表達水平的變化是否會影響巨噬細胞的表達改變,并且這些肝癌微環(huán)境針對MARCO和巨噬細胞的改變,會如何增強腫瘤的進展仍然不明。因此,MARCO-肝癌軸的具體調節(jié)機制還有待于進一步的工作證明,以及更大量的臨床樣品研究來確認MARCO作為腫瘤預后指標的可能性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：1517048