發(fā)布時間：2018-02-17 02:54

  本文關(guān)鍵詞： 肝癌 CD200受體 巨噬細(xì)胞膠原結(jié)構(gòu)受體 共抑制性受體 清道夫受體　出處：《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肝臟是人體中最大的實體器官。肝臟過濾來源于血液中的有害物質(zhì),儲存肝糖原作為能源,產(chǎn)生膽汁和消化脂肪,是重要的代謝器官。目前肝臟也被認(rèn)為是人體中的免疫器官之一,它具有許多獨特的免疫學(xué)特性,可以執(zhí)行許多重要的免疫功能。肝臟獨特的免疫功能與它的結(jié)構(gòu)是密不可分的。除了局部免疫反應(yīng)外,肝臟也可以調(diào)節(jié)全身固有免疫反應(yīng),在對抗病原體,寄生蟲及惡性腫瘤細(xì)胞中起到了重要的作用。肝臟主要由肝細(xì)胞組成,同時含有大量的NK細(xì)胞,NKT細(xì)胞及巨噬細(xì)胞。肝臟中含有最大的駐留巨噬細(xì)胞群(枯否細(xì)胞),占到了人體中所有組織巨噬細(xì)胞的80-90%。另外,肝臟中還含有大量浸潤單核細(xì)胞／巨噬細(xì)胞,特別是在肝損傷及感染時可以大幅增加巨噬細(xì)胞向肝臟的遷移與定居。成人原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC,包括肝癌和膽管癌)是全世界癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。肝癌構(gòu)成了肝臟中大部分的惡心腫瘤,它一般是由常見的臨床風(fēng)險因素所致,包括慢性乙肝病毒和丙肝病毒感染,大量酒精攝入,脂肪性肝炎,和糖尿病。大多數(shù)的肝癌都是由慢性乙肝病毒及丙肝病毒感染所致,慢性病毒感染會發(fā)展成為持續(xù)性的炎癥,導(dǎo)致纖維化／肝硬化伴隨著大量的淋巴細(xì)胞浸潤。腫瘤內(nèi)不同類型細(xì)胞和其基質(zhì)之間的cross-talk通常會誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)展。目前,肝癌切除術(shù)仍然是治療肝癌最有效的療法之一。由于較高的復(fù)發(fā)率,肝癌患者的整體術(shù)后存活率仍然不能令人滿意。為了研究巨噬細(xì)胞與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系并尋找可能的免疫預(yù)測方法,本論文開展了如下研究。Ⅰ. 抑制性受體CD200R的表達與肝癌預(yù)后密切相關(guān)免疫系統(tǒng)有自己的方法來平衡其免疫反應(yīng)及免疫耐受。一方面,免疫系統(tǒng)識別并且清除表達外來抗原的腫瘤細(xì)胞,而另一方面,它通過免疫耐受機制精細(xì)控制對于表達自身抗原的細(xì)胞的攻擊。同時,腫瘤細(xì)胞通過“免疫編輯”并利用免疫系統(tǒng)的免疫耐受機制逃避免疫攻擊。免疫逃逸的基本機制已被廣泛研究,其中之一是通過操控細(xì)胞活化后表達的免疫調(diào)控分子。一般認(rèn)為,在癌癥的發(fā)展過程中,免疫細(xì)胞會被耗盡并且其功能降低,使得腫瘤細(xì)胞更容易逃逸免疫應(yīng)答。免疫細(xì)胞的耗盡通常伴隨著共抑制分子的高表達,對這些負(fù)調(diào)分子的操控可以很好的恢復(fù)免疫應(yīng)答,從而起到對抗腫瘤細(xì)胞的作用。抑制性CD200:CD200R軸對于早期微生物感染時防止炎癥反應(yīng)和免疫病理至關(guān)重要。在幾種腫瘤模型中都已經(jīng)驗證了CD200的表達與癌癥的發(fā)展是密切相關(guān)的,且阻斷這條通路可以恢復(fù)抗腫瘤的免疫應(yīng)答。CD200廣泛表達于多種細(xì)胞類型,包括實體瘤和惡性血液瘤,而它的受體CD200R,主要表達在髓系來源和淋巴系來源的免疫細(xì)胞上。CD200-CD200R軸似乎有助于腫瘤細(xì)胞逃逸以及對免疫應(yīng)答的抑制。由于CD200-CD200R軸在不同的腫瘤模型中都抑制了免疫應(yīng)答,并且不同程度直接或者間接的干擾了免疫細(xì)胞的活動,我們因此探究了CD200-CD200R軸與肝癌之間的相關(guān)性。在我們的研究中我們發(fā)現(xiàn)肝癌患者中CD200及CD200R的表達明顯高于正常人。我們觀察到CD200R主要表達在巨噬細(xì)胞上而CD200廣泛分布于各種肝細(xì)胞及肝癌細(xì)胞上。癌周基質(zhì)(peritumoural stroma)也被稱為invasive margin,它連接了腫瘤的中心區(qū)域與腫瘤的遠(yuǎn)端區(qū)域。腫瘤中不同類型的細(xì)胞與其基質(zhì)之間的cross-talk現(xiàn)在被公認(rèn)為腫瘤發(fā)展的因素之一。癌周基質(zhì)有大量的白細(xì)胞浸潤,因此很容易就可以在顯微鏡下識別。CD200R主要表達在癌周基質(zhì)區(qū)域,提示了CD200R在抑制這些CD200R+浸潤白細(xì)胞中的作用。除了免疫組化染色觀察,IOD/area的值也用于代表肝癌患者中CD200R的表達量。較高的IOD/area意味著更高的表達,反之亦然。CD200R的IOD/area與肝癌患者的腫瘤直徑以及AFP都成正相關(guān),并且晚期肝癌患者及丟失了腫瘤包膜的肝癌患者的癌周基質(zhì)中的CD200R的表達遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于早期肝癌患者及腫瘤包膜完整患者,這些都表明了CD200R的表達隨著腫瘤的發(fā)展而累積,并且可以作為探測腫瘤發(fā)展的潛在標(biāo)志物。雖然癌癥患者的免疫抑制狀態(tài)眾所周知,大量的證據(jù)表明,在腫瘤局部發(fā)生的炎癥反應(yīng)同樣可以促進腫瘤的生長和發(fā)展。肝癌通常由伴隨著廣泛白細(xì)胞浸潤的肝硬化誘導(dǎo)而來。在這些浸潤的白細(xì)胞當(dāng)中,巨噬細(xì)胞來源的枯否細(xì)胞通常集中在癌周基質(zhì),而在腫瘤中心只有很少的巨噬細(xì)胞存在。通過在連續(xù)切片上對CD8,CD57和CD68進行免疫組化染色,我們再次證實了肝癌組織中大量CD68+細(xì)胞的存在。此外,大多數(shù)CD200R+細(xì)胞與CD68+細(xì)胞共定位,證實了在這種特殊狀態(tài)下CD68+巨噬細(xì)胞上CD200R的表達。值得注意的是,肝癌與其他惡性腫瘤不同,肝癌的預(yù)后不僅僅取決于腫瘤的分期,還取決于伴隨著的肝硬化引起的功能障礙。因此,我們進一步研究了CD200R在肝損傷中的作用。CD200R高表達患者和CD200R低表達患者之間AST水平的比較表明CD200R高表達的患者的血液中的AST表達也更高。肝癌患者通常伴有較高的腫瘤復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率,可以預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)志物的探索顯得尤為重要。在我們的研究中,我們發(fā)現(xiàn)CD200R高表達患者的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于CD200R低表達患者,預(yù)示了CD200R作為一個可預(yù)測肝癌預(yù)后復(fù)發(fā)及生存的指標(biāo)的可能性。我們的研究結(jié)果提示過強的CD200R信號通路可導(dǎo)致免疫耐受以抑制肝癌患者中的免疫功能。同時,也預(yù)示阻斷這條信號通路可以逆轉(zhuǎn)腫瘤的免疫逃逸以恢復(fù)抗腫瘤免疫應(yīng)答,提示了CD200R在提高免疫治療功效中潛在的作用。另一方面,CD200R信號通路不僅可以抑制免疫應(yīng)答,它同時也會抑制促進腫瘤的炎癥反應(yīng)。對CD200-CD200R相互作用的阻斷增強了抗腫瘤反應(yīng)的同時也增強了促進腫瘤的炎癥反應(yīng),這樣的炎癥反應(yīng)最終也將導(dǎo)致肝癌的發(fā)展。因此,當(dāng)用CD200R作為checkpoint來進行阻斷的同時其促進炎癥的這一方面也不容忽視。我們需要找到其中的平衡才能更好的使用它為臨床作出貢獻�？偠灾�,我們首次證明了癌周基質(zhì)中CD200R的表達可以作為潛在的指標(biāo)預(yù)測肝癌的發(fā)展和預(yù)后。CD200R高表達患者有可能伴隨更為嚴(yán)重的惡性腫瘤,更高的復(fù)發(fā)率和更低的生存率。因為目前針對肝癌治療的方法是非常有限的,CD200R可以被認(rèn)為是一個治療肝癌的潛在治療靶點。然而,詳細(xì)的機制需要進一步的研究,更多更全面的研究才能使我們到達這一目的。Ⅱ. MARCO氐表達與肝癌病程發(fā)展及患者生存預(yù)后密切相關(guān)天然免疫細(xì)胞可以通過包括清道夫受體(SR)等一系列的模式識別受體,來對外界抗原及病原體進行免疫識別。巨噬細(xì)胞膠原結(jié)構(gòu)受體(MARCO)來自于A類清道夫受體家族,其具體的特征是胞外段存在膠原和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域。兩種受體均在巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上表達,其功能是在多種細(xì)胞上作為分子傳感器,同時作為吞噬受體與各種微生物組分進行結(jié)合。然而,一些研究線索表明,清道夫受體除了模式識別和吞噬清除的功能外,還存在其他的潛在功能。MARCO表達于非常特定的巨噬細(xì)胞亞群,其表達會在機體發(fā)生細(xì)菌感染后在炎癥部位大量提升。這些特性提示我們,MARCO除了模式識別和吞噬清除的功能外,還發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫炎癥和免疫應(yīng)答的潛在功能。目前針對MARCO研究還始終缺乏系統(tǒng)深入的工作,尤其是對于在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,MARCO的表達與發(fā)揮作用幾乎沒有相應(yīng)研究,導(dǎo)致對于此方面的知識還存在空白。我們通過文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn),針對肝癌樣品大規(guī)模RNA測序和比較肝癌原發(fā)病灶組織和癌旁健康組織之間的差異表達基因,MARCO表達存在顯著性的差異,是差異表達最顯著的前30個基因之一。同時,肝臟富含巨噬細(xì)胞,是MARCO表達的主要細(xì)胞。這些前人的發(fā)現(xiàn)提示我們,MARCO在肝癌微環(huán)境中是否發(fā)揮著重要的作用?MARCO能否作為肝癌及其相關(guān)疾病的預(yù)后指標(biāo)?人類和小鼠的肝臟中均含有豐富的天然免疫淋巴細(xì)胞,如NK細(xì)胞,NKT細(xì)胞和枯否細(xì)胞。鑒于現(xiàn)有的證據(jù)表明,MARCO在巨噬細(xì)胞上高表達,我們進一步檢測了MARCO在肝臟中的可能發(fā)揮的潛在角色。有趣的是,公開基因表達數(shù)據(jù)庫(Oncomine, www.oncomine.org)中表明,在正常肝組織MARCO的mRNA表達比在HCC顯著升高。在我們的研究中發(fā)現(xiàn),通過免疫組化染色檢測MARCO在肝癌組織中的表達水平,將IOD/area做為MARCO蛋白表達的量度。較高的IOD/area意味著更高的表達,反之則意味著MARCO表達降低。與基因表達數(shù)據(jù)庫的結(jié)果一致,在我們的肝癌組織和癌旁組織樣品中,無論是蛋白質(zhì)水平和mRNA的表達水平,MARCO在腫瘤內(nèi)組織顯著低于癌旁正常組織,提示MARCO在肝癌組織微環(huán)境中,發(fā)揮著重要作用。此外,我們的研究結(jié)果顯示,MARCO在健康志愿者的肝臟中的表達水平最高,其次是肝硬化患者,肝癌患者,肝癌轉(zhuǎn)移患者,而這又與基因數(shù)據(jù)庫的結(jié)論相統(tǒng)一。我們還進一步發(fā)現(xiàn),在腫瘤周圍間質(zhì)區(qū)域和癌組織之間,MARCO表達會形成很明顯的一條清晰邊界,在癌內(nèi)MARCO表達明顯的低于癌旁的組織。健康對照組的MARCO表達顯著性高于肝癌患者和肝癌轉(zhuǎn)移患者,MARCO的表達隨著肝癌病情的加重,會在肝臟組織中逐漸降低。通過進一步的分析,我們發(fā)現(xiàn)MARCO表達水平不僅會伴隨著疾病的進程而越來越低,MARCO的表達與腫瘤的分期進展密切相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),處在TNM早期患者的肝臟組織中MARCO表達水平顯著高于處在TNM晚期的患者,而且在有明顯腫瘤包膜的患者體內(nèi)MARCO表達也會顯著高于沒有腫瘤包膜的患者,這兩個參數(shù)通常都與腫瘤的嚴(yán)重性密切相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明,MARCO表達水平會沿著疾病進程和腫瘤進展,而逐漸減少減低,提示我們在預(yù)測肝癌相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中,MARCO存在作為腫瘤預(yù)后標(biāo)志物的潛能。盡管癌旁組織與癌組織比較,往往會被認(rèn)為是“相對正常”組織,然而癌旁組織在鏡下觀察,也會存在不同程度的炎癥反應(yīng)�？莘窦�(xì)胞是肝臟駐留的巨噬細(xì)胞,其與肝臟內(nèi)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在識別外來抗原方面,枯否細(xì)胞可以被活化并釋放多種炎癥介質(zhì),包括多種細(xì)胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-6),趨化因子(單核細(xì)胞趨化蛋白-1,MCP-1),巨噬細(xì)胞炎性蛋白(MIP)-1α,MIP-1β和RANTES等。我們的結(jié)果中通過激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn),CD68+巨噬細(xì)胞標(biāo)記和MARCO+標(biāo)記會共定位在同一細(xì)胞上,證實在肝癌組織中MARCO的表達主要是在枯否細(xì)胞上表達。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,可以嚴(yán)重影響術(shù)后生活質(zhì)量和術(shù)后存活率。在我們的研究中發(fā)現(xiàn),MARCO的表達與患者術(shù)后的生存預(yù)后密切相關(guān),肝癌組織中高表達MARCO的患者會伴隨著更久的生存周期時間,這些結(jié)果提示MARCO在HCC患者中具有預(yù)測生存預(yù)后的價值。終上所述,本研究工作首次闡明了MARCO和肝癌之間的相互關(guān)系。尤其是我們的結(jié)果表明,患者的肝癌組織內(nèi)低表達MARCO,會伴隨著更差的疾病預(yù)后和生存周期下降。在本研究工作中,我們提供了充分的證據(jù)表明MARCO在肝癌病人中發(fā)揮著重要角色,這些發(fā)現(xiàn)之前都沒有被研究和報道過。然而,MARCO在肝癌患者中低表達是否是疾病惡化的原因或只是其預(yù)后不良的結(jié)果仍存在不清楚的地方。一方面,鑒于MARCO主要表達于巨噬細(xì)胞,但駐留在肝癌腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞較少,所以檢測到的MARCO表達強度降低可能是由于在肝癌組織中的巨噬細(xì)胞表達減少導(dǎo)致。另一方面,MARCO表達水平的變化是否會影響巨噬細(xì)胞的表達改變,并且這些肝癌微環(huán)境針對MARCO和巨噬細(xì)胞的改變,會如何增強腫瘤的進展仍然不明。因此,MARCO-肝癌軸的具體調(diào)節(jié)機制還有待于進一步的工作證明,以及更大量的臨床樣品研究來確認(rèn)MARCO作為腫瘤預(yù)后指標(biāo)的可能性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：1517048