本文關(guān)鍵詞： ROS 細(xì)胞極性 單核細(xì)胞浸潤 乳腺癌 3D細(xì)胞培養(yǎng)　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:細(xì)胞極性(Cell Polarity)是正常上皮組織的基本特征,細(xì)胞極性的破壞是乳腺癌發(fā)生過程中的一個(gè)早期細(xì)胞事件。細(xì)胞極性破壞將導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)紊亂、增加乳腺癌的發(fā)生易感性并最終形成乳腺癌,而ROS水平的升高和相關(guān)的氧化應(yīng)激是乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力,誘導(dǎo)DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞成分的氧化性損傷并引起乳腺細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化,但目前國內(nèi)外的研究還缺少ROS水平是否決定上皮細(xì)胞極性的維持、是否決定單核細(xì)胞的浸潤的證據(jù)。目的:探討乳腺正常極化腺泡結(jié)構(gòu)的破壞及單核細(xì)胞浸潤與ROS水平升高的關(guān)聯(lián)性,證實(shí)ROS水平升高破壞乳腺上皮細(xì)胞極性后促進(jìn)單核細(xì)胞的浸潤,進(jìn)而明確ROS對(duì)乳腺癌上皮細(xì)胞極性變化及單核細(xì)胞浸潤調(diào)控的機(jī)制。方法:1.應(yīng)用體外3D培養(yǎng)系統(tǒng)模擬體內(nèi)生理微環(huán)境,3D培養(yǎng)HMT-3522人乳腺癌細(xì)胞系(包括極化的S1細(xì)胞和非極化的T4-2細(xì)胞)和MCF-10A人正常乳腺上皮細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察基底標(biāo)志物α6-integrin在細(xì)胞中的表達(dá)分布情況來評(píng)估細(xì)胞極性,細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67陽性率來評(píng)估細(xì)胞增殖情況,Cell ROX Deep Red紅色熒光強(qiáng)度來評(píng)估細(xì)胞內(nèi)ROS水平。2.分別應(yīng)用表皮生長因子受體抑制劑Tyrphostin AG1478(TYR)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑GM6001(GM)或PI3K抑制劑LY294002(LY)處理3D培養(yǎng)的極性紊亂的T4-2細(xì)胞(非極化),使其結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)恢復(fù)為正常的T4R細(xì)胞(極化)。實(shí)時(shí)活細(xì)胞染色(Cell ROX Deep Red)檢測比較S1/T4R細(xì)胞和T4-2細(xì)胞ROS水平。3.分別包裝過表達(dá)RAC1 L61(破壞細(xì)胞極性)的慢病毒和過表達(dá)Myr-Akt(促進(jìn)細(xì)胞增殖)的慢病毒,并感染S1、T4R或MCF-10A細(xì)胞,觀察細(xì)胞極性和細(xì)胞增殖的變化,以確定ROS水平升高引起的細(xì)胞極性破壞是否依賴于細(xì)胞增殖。4.使用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)或還原型谷胱甘肽(L-glutathione Reduced,GSH)降低非極化的T4-2細(xì)胞ROS水平,使用葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GO)升高極化的S1細(xì)胞或MCF-10A細(xì)胞ROS水平,以確定ROS水平變化對(duì)乳腺極化腺泡結(jié)構(gòu)形成的影響。5.HMT-3522細(xì)胞/MCF-10A細(xì)胞與單核細(xì)胞(GFP標(biāo)記的THP-1細(xì)胞、CMFDA標(biāo)記的人CD14+原代單核細(xì)胞)體外3D共培養(yǎng),熒光顯微鏡觀察單核細(xì)胞浸潤的程度,以確定升高ROS水平破壞極化腺泡結(jié)構(gòu)后對(duì)單核細(xì)胞浸潤的影響。6.利用熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)和免疫印跡法(Western Blot)檢測NF-κB活性。分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA方法檢測3D培養(yǎng)中的非極化的T4-2細(xì)胞和極化的S1/T4R細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)水平,以確定ROS水平升高引起的細(xì)胞極性破壞是否通過激活NF-κB提高細(xì)胞因子的表達(dá)并促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤。7.應(yīng)用海馬細(xì)胞能量代謝實(shí)時(shí)測定儀(Seahorse XF96)檢測S1細(xì)胞和T4-2細(xì)胞耗氧率(Oxygen Consumption Rate,OCR)并結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測S1細(xì)胞和T4-2細(xì)胞NDUFA11表達(dá)水平,以探討非極化乳腺癌細(xì)胞ROS水平升高的機(jī)制。結(jié)果:1.乳腺癌上皮細(xì)胞極性變化與ROS水平的關(guān)系:實(shí)時(shí)活細(xì)胞染色檢測結(jié)果顯示,非極化的乳腺癌T4-2細(xì)胞ROS水平顯著高于極化的S1細(xì)胞,是S1細(xì)胞的1.96倍(p0.05);TYR、GM或LY逆轉(zhuǎn)T4-2細(xì)胞極性后ROS水平隨之明顯下降,分別降低至40%、53%、59%(p0.05)。2.乳腺癌上皮細(xì)胞極性破壞與細(xì)胞增殖:(1)過表達(dá)RAC1 L61能顯著提高TYR處理的T4-2細(xì)胞ROS水平(p0.05),同時(shí)抑制TYR引起T4-2細(xì)胞極性的逆轉(zhuǎn)(p0.001),但對(duì)細(xì)胞增殖的影響很小(p=0.42);過表達(dá)Myr-Akt顯著的促進(jìn)了TYR處理的T4-2細(xì)胞增殖(p0.001),但對(duì)ROS水平的影響并不明顯(p=0.07)。(2)極化的S1細(xì)胞過表達(dá)RAC1 L61后,細(xì)胞極性破壞,與對(duì)照相比ROS水平明顯升高(p0.05);過表達(dá)Myr-Akt后與TYR處理的T4-2細(xì)胞類似,只促進(jìn)了細(xì)胞增殖但并不明顯影響ROS水平(p=0.09)。(3)極化的MCF-10A細(xì)胞過表達(dá)RAC1 L61后,細(xì)胞的極性消失,與對(duì)照相比ROS水平明顯升高(p0.001);過表達(dá)Myr-Akt后與TYR處理的T4-2細(xì)胞類似,只促進(jìn)了細(xì)胞增殖并不明顯影響ROS水平(p=0.10)。3.ROS水平升高與腺泡極化結(jié)構(gòu)的形成:抗氧化劑NAC或GSH處理T4-2細(xì)胞使ROS水平顯著降低(p0.01),重編T4-2細(xì)胞使其恢復(fù)形成極化的腺泡球體結(jié)構(gòu)(p0.001),同時(shí)細(xì)胞增殖水平顯著下降(p0.001);GO處理S1細(xì)胞升高了ROS水平(p0.001),并破壞了極化腺泡的形成(p0.001);GO處理MCF-10A細(xì)胞升高了ROS水平(p0.001),并破壞了極化腺泡的形成(p0.05)。4.腺泡極化結(jié)構(gòu)破壞后對(duì)單核細(xì)胞浸潤的影響:乳腺上皮細(xì)胞與單核細(xì)胞3D共培養(yǎng),非極化的乳腺癌T4-2細(xì)胞可招募單核細(xì)胞浸潤,應(yīng)用抗氧化劑NAC或GSH降低T4-2細(xì)胞ROS水平恢復(fù)其極性后能夠明顯抑制單核細(xì)胞浸潤(p0.001);極化的S1細(xì)胞招募單核細(xì)胞能力差,應(yīng)用GO升高S1細(xì)胞ROS水平破壞其極性結(jié)構(gòu)后可顯著促進(jìn)單核細(xì)胞浸潤(p0.001)。5.ROS水平對(duì)乳腺癌細(xì)胞NF-κB活性和細(xì)胞因子表達(dá)的影響:(1)熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示,3D培養(yǎng)的T4R細(xì)胞NF-κB活性較T4-2細(xì)胞明顯降低,NAC處理T4-2細(xì)胞后NF-κB活性隨之明顯降低。(2)Western Blot檢測結(jié)果顯示,與極化的S1細(xì)胞相比,非極化的T4-2細(xì)胞磷酸化p-65(p-p65,Ser536位點(diǎn))水平升高至2.50倍(p0.05),核蛋白p65表達(dá)水平升高至1.43倍(p0.05);TYR處理T4-2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)其極性后,p-p65和核蛋白p65表達(dá)水平分別降低至60%、50%(p0.05);NAC處理T4-2細(xì)胞,p65磷酸化水平下降至50%并降低核蛋白p65水平至原來的40%(p0.05)。(3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,與極化的S1細(xì)胞相比,非極化的T4-2細(xì)胞因子IL-24、CXCL1、CXCL3和CXCL8m RNA表達(dá)水平分別升高至131倍、78倍和21倍(p0.05),TYR處理T4-2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)其極性后IL-24、CXCL1、CXCL3和CXCL8表達(dá)水平也隨之下降;應(yīng)用蟛蜞菊內(nèi)酯抑制T4-2細(xì)胞NF-κB活性,細(xì)胞因子IL-6、IL-24、IL-32、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6和CXCL8的m RNA表達(dá)水平分別降低至70%、51%、74%、50%、55%、37%、39%和73%(p0.05);NAC處理3D培養(yǎng)的T4-2細(xì)胞,IL-6、IL-24、CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8的m RNA表達(dá)水平分別降低至19%、27%、15%、35%、18%和14%(p0.05);GO處理3D培養(yǎng)的S1細(xì)胞,IL-6、IL-24、IL-32、CXCL1、CXCL2、CXCL6和CXCL8 m RNA的表達(dá)水平分別升高至6.87倍、7.27倍、3.43倍、4.46倍、2.79倍、4.28倍和14.66倍(p0.05)。(4)ELISA檢測結(jié)果顯示,與極化的S1細(xì)胞相比,非極化的T4-2細(xì)胞IL-6、CXCL1表達(dá)水平分別升高至241倍、4倍(p0.05);NAC處理3D培養(yǎng)的T4-2細(xì)胞,IL-6、CXCL1蛋白表達(dá)水平分別降低至50%、49%(p0.05)。6.線粒體氧化磷酸化與ROS水平的關(guān)系:海馬生物能量測定結(jié)果顯示,與S1細(xì)胞相比,T4-2細(xì)胞線粒體基礎(chǔ)代謝率、ATP轉(zhuǎn)換、極限呼吸率和備用呼吸容量分別上調(diào)至1.27倍、1.46倍、1.41倍和1.66倍(p0.05)。q RT-PCR和Western Blot檢測結(jié)果顯示3D培養(yǎng)的T4-2細(xì)胞NDUFA11表達(dá)水平顯著高于S1細(xì)胞。結(jié)論:1.RAC1是調(diào)控ROS產(chǎn)生和細(xì)胞極性破壞的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器,即RAC1促進(jìn)ROS產(chǎn)生進(jìn)而破壞腺泡極化結(jié)構(gòu)的形成。2.ROS水平升高破壞乳腺癌上皮細(xì)胞極性,乳腺腺泡極化結(jié)構(gòu)的破壞直接導(dǎo)致ROS水平升高,ROS水平升高是破壞乳腺腺泡極化結(jié)構(gòu)形成的一個(gè)充分必要條件,ROS水平升高引起的細(xì)胞極性破壞不依賴于細(xì)胞增殖。3.ROS水平升高破壞乳腺上皮細(xì)胞極性后促進(jìn)了NF-κB的激活,NF-κB的激活進(jìn)而促進(jìn)大量細(xì)胞因子如IL-6、IL-24、IL-32、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6和CXCL8的分泌,細(xì)胞因子招募單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞到達(dá)腫瘤部位,促進(jìn)乳腺癌發(fā)展。4.非極化的乳腺癌細(xì)胞線粒體NDUFA11表達(dá)上調(diào),氧化磷酸化水平升高,是ROS水平升高的一個(gè)原因。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：1511744