本文關鍵詞： 鯊烯環(huán)氧化酶 肝細胞癌 細胞生長 細胞遷移 ERK信號　出處：《東南大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：原發(fā)性肝癌居腫瘤相關死因的第三位,其中90%以上的病例為肝細胞癌。多項研究表明膽固醇代謝在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,使用他汀抑制腫瘤細胞中膽固醇的合成對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有顯著抑制作用。由于他汀的靶點]HMGCR位于膽固醇合成上游位置,其在抑制膽固醇合成的同時,對其他終產物也存在抑制作用。因此,他汀的副作用亦不可忽視,從膽固醇合成通路的下游尋找新的治療靶點尤為重要。鯊烯環(huán)氧化酶(SQLE)位于膽固醇合成的下游。已有研究表明SQLE在乳腺癌、胰腺癌、直結腸癌等腫瘤中的表達發(fā)生異常。但是SQLE在肝細胞癌中的表達模式、相關功能及分子機制不明。為了揭示SQLE在肝癌組織中的表達模式,借助于熒光定量PCR、免疫組化和Western Blot技術,我們檢測了肝癌組織及配對的正常組織中SQLE的mRNA水平和蛋白水平。實驗結果顯示,與配對的正常組織相比,SQLE在肝癌組織中的表達水平呈現上調趨勢。SQLE在肝細胞和腫瘤細胞中的表達水平與腫瘤細胞的惡性程度有一定相關性。這提示SQLE的表達很可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展。上調SQLE的表達促進肝癌細胞生長、遷移及其在軟瓊脂上的克隆形成能力。在肝癌細胞中下調SQLE的表達抑制腫瘤細胞生長、遷移及其在軟瓊脂上的克隆形成能力。而且,沉默SQLE在肝癌細胞中的表達抑制腫瘤細胞在裸鼠體內的轉移能力。進一步的機制研究顯示,SQLE過表達激活Ras-ERK信號,上調ERK的磷酸化水平。綜上所述,SQLE通過激活Ras-ERK信號從而促進肝癌細胞的惡性行為。我們的研究可以分為如下兩個部分。第一章SQLE在肝癌組織和細胞中表達上調研究目的：研究肝癌組織及配對的正常組織、正常肝細胞及肝癌細胞株中SQLE的蛋白水平和mRNA水平,確定SQLE在肝癌中的表達模式。研究方法：利用熒光定量PCR檢測SQLE在40例肝癌組織及配對的正常組織中的表達；隨機挑取6例肝癌組織及配對的正常組織,利用Western Blot檢測SQLE的蛋白水平,對熒光定量PCR的結果進行驗證,從中挑取1例肝癌組織及配對的正常組織,利用免疫組化染色檢測SQLE的蛋白水平,進一步確定熒光定量PCR的結果；利用Western Blot檢測SQLE在正常肝細胞和肝癌細胞中的表達。研究結果：與配對的正常組織相比,SQLE的mRNA水平在肝癌組織中上調；免疫組化染色和Western Blot結果顯示,SQLE蛋白水平在肝癌組織中升高,進一步驗證了熒光定量PCR的結果；SQLE的表達與細胞株的惡性程度相關,在正常肝細胞株中SQLE的表達水平較低,在肝癌細胞株中SQLE的表達水平較高。結論：SQLE在肝癌組織和肝癌細胞中表達水平上調。這提示SQLE很可能在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。第二章SQLE對肝癌細胞惡性行為及ERK信號的影響研究目的：研究SQLE的表達對肝癌細胞生長、遷移、非錨定性克隆集落和體內轉移能力的影響,揭示SQLE在肝癌中的功能。研究方法：構建SQLE表達載體,利用脂質體轉染在肝癌細胞HepG2、 7404中過表達SQLE;以結晶紫法檢測SQLE表達上調對肝癌細胞生長的影響;以軟瓊脂集落法研究過表達SQLE對肝癌細胞非錨定性生長能力的影響；以Boyden Chamber細胞遷移模型檢測過表達SQLE對肝癌細胞體外遷移能力的影響。同時,構建RNA干擾的病毒載體,在肝癌細胞HepG2、 MHCC97中沉默SQLE的表達；以結晶紫法檢測SQLE表達下調對肝癌細胞生長的影響；以軟瓊脂集落法檢測SQLE下調后肝癌細胞克隆形成的變化；以Boyden Chamber細胞遷移模型檢測下調SQLE的表達對肝癌細胞遷移能力的影響；利用心臟注射,結合小動物體內成像平臺,檢測SQLE表達下調對肝癌細胞體內轉移能力的影響。在上述實驗的同時,檢測SQLE的表達對ERK磷酸化水平的影響。研究結果：通過脂質體轉染和G418抗性篩選,在肝癌細胞HepG2和7404中建立了過表達SQLE的穩(wěn)定表達細胞株。通過結晶紫實驗、Boyden Chamber實驗和軟瓊脂集落實驗,我們發(fā)現過表達SQLE促進肝癌細胞HepG2和7404的生長、遷移和在軟瓊脂上的非錨定性生長的能力。同時,通過成功構建了SQLE RNA干擾的慢病毒載體,在肝癌細胞HepG2、 MHCC97中干擾SQLE的表達。通過結晶紫實驗、Boyden Chamber實驗和軟瓊脂集落實驗,我們發(fā)現下調SQLE的表達抑制肝癌細胞HepG2和MHCC97的生長、遷移和在軟瓊脂上的非錨定性生長的能力。體內實驗表明,干擾SQLE在HepG2中的表達抑制肝癌細胞在裸鼠體內的遷移能力。另一方面,SQLE在肝癌細胞中的表達顯著上調ERK的磷酸化水平,干擾SQLE的表達抑制ERK的磷酸化。并且,干擾ERK的表達解除了SQLE對肝癌細胞生長的促進作用。結論：SQLE在肝癌細胞中的表達促進肝癌細胞生長、遷移、克隆形成和體內轉移,SQLE通過活化ERK信號通路對肝癌的發(fā)生發(fā)展起重要的促進作用。
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【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7

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本文編號：1509500