本文關鍵詞： 結直腸癌 分子機制 p110αE545K p85β 8-羥基脫氧鳥苷 葉酸受體　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究目的癌癥仍然是困擾人類的世界性醫(yī)學問題,探討癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機制對于認清癌癥本質(zhì)、攻克癌癥難題具有非常重要的意義。同時,建立與腫瘤相關的生物標志物的檢測方法,能為癌癥的早期篩查提供重要的方法學基礎。因此,本論文的研究目的有以下幾個方面:(1)研究結直腸癌細胞IRS1和p110αE545K的特征及其對下游信號的影響,探究這兩種蛋白在結直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用;(2)研究PI3K調(diào)節(jié)亞基p85β,在含有p110αE545K突變的結直腸癌中可能存在的新的生物學功能及其分子機制;(3)發(fā)掘發(fā)揮該生物學功能的關鍵基因信息,并探討其與p85β生物功能的相關性;(4)建立檢測與癌癥發(fā)生相關的DNA氧化性損傷生物標志物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHd G)和腫瘤標志物葉酸受體(FR1)的簡便準確的分析方法,為癌癥的早期診斷和篩查提供方法學基礎。研究方法1.在人結直腸癌DLD1細胞和p110α只含有E545K突變型等位基因的DLD1細胞(以下簡稱DLD1 Mut-only細胞)的基礎上,分別將IRS1基因敲除。利用蛋白印跡和表型分析的方法,比較敲除IRS1前后,細胞相關蛋白的表達水平變化及細胞凋亡、平板集落和軟瓊脂集落形成的能力,探究IRS1對癌細胞的重要性。2.在DLD1 Mut-only細胞的基礎上,構建p110αD933A突變及p110αE545K基因敲除細胞系。利用蛋白印跡和表型分析的方法,比較突變及敲除p110α前后,細胞相關蛋白的表達水平變化及細胞凋亡、平板集落和軟瓊脂集落形成的能力,探究p110α對癌細胞的重要性。3.在人結直腸癌DLD1細胞、只含有野生型p110α等位基因的DLD1細胞(以下簡稱DLD1 WT-only細胞)、DLD1 Mut-only細胞、HCT116細胞、RKO細胞以及SW480細胞中,利用免疫共沉淀的方法,探討p110α、IRS1、p85a及p85β的相互作用關系。4.在DLD1 Mut-only細胞基礎上,將p85β基因敲除,構建p85βKO細胞系。通過表型分析(包括細胞凋亡、平板集落和軟瓊脂集落形成、裸鼠異種移植瘤模型)研究p85β基因敲除前后細胞表型的變化,從而確定p85β的生物學功能。在此基礎上,通過蛋白印跡技術研究與p85β生物學功能相關的分子機制。5.在DLD1 WT-only細胞、DLD1 Mut-only細胞、HCT116 WT-only細胞(p110α只含有野生型等位基因的HCT116細胞)、HCT116 Mut-only細胞(p110α只含有H1047R突變型等位基因的HCT116細胞)中,利用免疫熒光染色及激光共聚焦技術,確定p85β的細胞定位情況。6.利用“c NLS Mapper”預測p85β的關鍵核定位信息,在p85βKO細胞的基礎上,構建HA標記的野生型p85β及HA標記的關鍵核定位信號突變的p85β過表達細胞系。通過免疫熒光染色及激光共聚焦技術,對預測得到的p85β的關鍵核定位信息進行驗證。7.在DLD1基礎上,利用CRISPR-Cas9技術構建關鍵核定位信號突變的p85β基因敲入細胞系。通過裸鼠異種移植瘤模型,在人結直腸癌DLD1親代細胞上,驗證與p85β致癌功能相關的關鍵基因信息。8.利用抗原抗體的特異性反應及免疫膠體金技術,通過吸光光度法建立與腫瘤相關的生物標志物8-羥基脫氧鳥苷(8-OHd G)的分析方法。9.利用抗原抗體的特異性反應及免疫膠體金技術,通過共振瑞利散射法建立腫瘤標志物葉酸受體(FR)的檢測方法。研究結果在DLD1或DLD1 Mut-only細胞基礎上,將IRS1基因敲除后,p110αE545K的蛋白表達也隨之降低,而p85β的表達量不受影響。IRS1基因敲除后,下游p AKT表達量下降,而對MAPK信號通路無影響。敲除IRS1基因可以促進癌細胞發(fā)生自主性凋亡,抑制癌細胞的平板集落和軟瓊脂集落的形成能力,從而降低癌細胞的惡性程度。p110αE545K基因突變及敲除后,IRS1和p85β的表達量均不會受到影響,下游p AKT表達量下降,而對MAPK信號通路無影響。從表型分析結果看出,p110αE545K基因敲除也可以降低癌細胞的惡性程度。在DLD1 WT-only和DLD1 Mut-only兩種癌細胞系中,p85a均結合在p110α上。在DLD1 WT-only癌細胞系中,p85β同時與p110α及IRS1相結合,發(fā)揮其調(diào)節(jié)亞基的作用。而在DLD1 Mut-only癌細胞系中,p85β從p110αE545K中解離下來,且解離下來的p85β也不再與IRS1發(fā)生相互結合。p85β從p110α解離下來的事實只特異于含有p110αE545K突變的細胞系,在其他人結直腸癌細胞中沒有該現(xiàn)象。為研究p85β的生物學功能,我們在含有p110αE545K突變的人結直腸癌細胞系中構建了p85β基因敲除細胞系。p85β基因敲除后,癌細胞的凋亡數(shù)增加、平板集落和軟瓊脂集落數(shù)下降、在裸鼠兩側接種的異種移植瘤的形成能力降低。這些結果表明游離的p85β在含有p110αE545K突變的腫瘤細胞中也具有了一定的致癌活性。分子機制研究顯示,p85β的該項功能可能與JNK/c-jun信號通路有關。通過免疫熒光染色對p85β進行細胞定位時發(fā)現(xiàn),只有在含有p110αE545K突變的人結直腸癌細胞系中,解離下來的p85β進入了細胞核,而在其他細胞中,p85β均位于胞漿。對p85β的關鍵核定位信息分析顯示,位于整個p85β氨基酸序列第477和478位的賴氨酸和精氨酸“KR”對p85β在p110αE545K突變型癌細胞中入核的行為非常關鍵。將這兩個關鍵氨基酸突變成“AA”(兩個丙氨酸),然后在p85βKO細胞基礎上分別過表達野生型p85β和突變型p85β,發(fā)現(xiàn)野生型p85β質(zhì)粒穩(wěn)轉后,p85β仍然入核;而突變型p85β質(zhì)粒穩(wěn)轉后,p85β則在胞漿。裸鼠異種移植瘤模型結果表明,在人結直腸癌DLD1細胞基礎上,將p85β基因的“KR”突變成“AA”后,癌細胞的成瘤能力明顯減弱。以上結果說明,“KR”序列確實是p85β的關鍵入核信號,且該信號對p85β的致癌性能關系重大。另一方面,對與腫瘤相關的生物標志物8-OHd G的檢測結果顯示,免疫膠體金吸收波長紅移的波長數(shù)和8-OHd G的濃度呈很好的線性關系,檢測范圍0.25-5.00mg/m L,最低檢出限25 ng/m L。且隨著8-OHd G的濃度的增大,膠體金的顏色從紅逐漸變紫甚至變藍,根據(jù)顏色的變化實現(xiàn)了8-OHd G的半定量可視化檢測。透射電鏡結果顯示,波長的移動和顏色的變化與膠體金聚集狀態(tài)有關。通過共振瑞利散射的信號增強和濃度之間的線性關系實現(xiàn)了對葉酸受體FR1的簡單快速定量測定。線性范圍0.50-37.50 ng/m L,最低檢出限0.05 ng/m L。利用共振瑞利散射作為響應信號,大大提高了檢測方法的靈敏度。結論在結直腸癌分子機制的研究中,我們發(fā)現(xiàn)IRS1及p110αE545K對于DLD1癌細胞形成的腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關重要,二者通過AKT信號通路發(fā)揮致癌作用。在含有p110αE545K突變的人結直腸癌DLD1細胞中,p85其中的一種亞型p85β從p110αE545K蛋白上特異性地解離下來,解離下來的p85β也不再與IRS1結合。游離的p85β特異性的進入了含有p110αE545K突變的DLD1癌細胞的細胞核中。入核后的p85β本身也具有了一定的致癌活性,且p85β的入核行為及致癌活性與其序列中位于第477位和478位的“KR”具有重要相關性。在與腫瘤相關的生物標志物的分析方法方面,我們成功建立了兩種標志物(8-OHd G和FR1)的檢測方法,該方法具有快速方便,操作簡單,選擇性好等優(yōu)點。本論文的創(chuàng)新性(1)發(fā)現(xiàn)了不與p110α結合的獨立的p85β的新的生物學功能,并揭示了發(fā)揮該新生物學功能的關鍵基因信息,為腫瘤藥物設計篩選和臨床治療提供一個極具前景的新靶點。(2)建立了兩種與腫瘤相關的生物標志物的簡單快速的分析檢測方法,為癌癥的早期診斷提供重要的方法學理論依據(jù)。局限性及未來計劃本文仍存在局限性,表現(xiàn)在:(1)對基于DLD1構建的p85βKR突變基因敲入細胞的表型分析不夠全面;(2)對可能影響p85β生物學功能的分子機制的研究不夠深入明晰;(3)實驗建立的對8-OHd G的檢測方法的靈敏度有待進一步提高。針對以上不足,未來將對實驗進行完善和優(yōu)化。(1)對p85βKR突變基因敲入細胞進行多種表型分析,如細胞凋亡、集落形成及軟瓊脂等實驗;(2)查閱文獻,進一步分析研究影響p85β生物學功能的下游信號通路,找到能合理解釋p85β致癌活性的分子機制;(3)嘗試對納米材料進行其他修飾表征,提高檢測指標的靈敏度。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.4

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