發(fā)布時間：2018-02-13 13:03

  本文關鍵詞： 胰腺癌 YAP 預后 胰腺癌 YAP 侵襲 血管生成 缺氧誘導因子1α Hippo通路 EMT 侵襲胰腺癌 維替泊芬 凋亡 血管生成　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：胰腺癌,其主要的病理類型為胰腺導管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC),是惡性程度極高的消化道腫瘤,號稱"癌中之王";五年生存率不足5%。由于肥胖、高脂飲食、糖尿病、吸煙、酒精依賴及慢性胰腺炎等原因,胰腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。胰腺癌起病隱匿,僅有15%-20%的病人獲得根治性手術機會,并且胰腺癌容易發(fā)生早期轉移、對傳統(tǒng)放化療不敏感及治療方法的局限,造成其高死亡率。因此,深入研究胰腺癌的早期轉移機制,探索新的治療方法顯得極其重要。近年研究表明Hippo通路通過調控細胞增殖與凋亡參與器官發(fā)育、干細胞全能性維持等過程。最新研究表明Hippo通路在腫瘤發(fā)生、進展及轉移過程中也發(fā)揮了重要作用。YAP(Yes associated protein1,YAP)基因是Hippo通路中的最核心轉錄共激活因子。Hippo通路參與到一系列激酶的激活過程導致YAP在細胞漿中磷酸化降解;非磷酸化的YAP可以進入到細胞核參與一系列的轉錄因子激活過程,如TEADs、SMAD、RUNX和CTGF等。YAP基因還參與腫瘤干細胞維持、上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)、遷移及侵襲和化療耐藥等多種腫瘤生物學行為。高表達的YAP在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及復發(fā)過程中發(fā)揮了重要作用。但目前對YAP如何調控腫瘤微環(huán)境、促進腫瘤侵襲及血管生成的相關機制還不明確。缺氧微環(huán)境廣泛存在于實體腫瘤中,并且和腫瘤侵襲、細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)降解及上皮間質轉化等密切相關。缺氧誘導因子1a(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是缺氧通路最重要的轉錄因子,在胰腺癌的進展及轉移過程中發(fā)揮了重要作用。胰腺癌中HIF-1α高表達,并且和腫瘤侵襲、細胞外基質降解及上皮間質轉化等行為相關。YAP的活化也和細胞外基質中的氧濃度密切相關。因此研究缺氧條件下Hippo通路如何調控胰腺癌的侵襲具有重要意義。維替泊芬(Veterporfin,VP)是臨床中應用的光敏劑,主要用于治療年齡相關的黃斑變性。研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬可以通過干擾YAP-TEAD復合體的形成,抑制Hippo通路相關蛋白表達。維替泊芬還可以通過抑制YAP表達,抑制腫瘤發(fā)生、侵襲及血管生成;但維替泊芬在胰腺癌中抗腫瘤的作用及機制尚不明確。因此深入研究維替泊芬的抗腫瘤機制,將為胰腺癌的治療提供新的思路。本實驗將研究YAP在胰腺癌中的表達分布,分析YAP表達與臨床病理指標間的關系,并深入探究YAP基因調控胰腺癌遷移、侵襲及血管生成的作用和機制;我們還將進一步研究缺氧條件下Hippo通路失活的分子機制;同時我們也將研究Hippo通路抑制劑維替泊芬在胰腺癌中抗腫瘤的作用及機制;這將為胰腺癌靶向YAP的治療提供實驗及理論依據(jù)。第一部分YAP在胰腺癌組織中的表達及其意義研究目的:本部分主要研究YAP在胰腺癌組織及癌旁組織中mRNA及蛋白表達水平;分析胰腺癌組織中YAP表達和臨床病理指標間的相關性,并分析YAP與胰腺癌病人術后預后之間的關系。研究方法:本實驗獲得山東大學附屬山東省千佛山醫(yī)院倫理委員會批準,共在山東省千佛山醫(yī)院獲取19例胰腺癌手術標本,所有胰腺癌病人已簽署知情同意書。同時利用胰腺癌組織芯片,分析YAP與胰腺癌病人術后預后之間的相關性。1.YAP的mRNA及蛋白在胰腺癌及癌旁組織中的表達檢測:獲取胰腺癌新鮮冰凍標本,利用qRT-PCR,Western Blot及免疫熒光技術檢測YAP的mRNA及蛋白表達水平。2.胰腺癌中YAP表達水平和病人臨床病理指標之間的相關性分析:利用胰腺癌組織芯片,采用免疫組化檢測YAP表達水平,采用χ2檢驗分析胰腺癌組織及癌旁組織中YAP差異表達,并分析胰腺癌組織中YAP與病人臨床病理資料之間的相關性。3.胰腺癌組織中YAP表達和病人術后預后之間的相關性:采用Kaplan-Meier分析繪制生存曲線,分析YAP表達水平和胰腺癌病人術后生存期的關系。結果:1.胰腺癌中YAP的mRNA及蛋白在腫瘤組織中高表達。2.在胰腺癌組織芯片中,我們發(fā)現(xiàn)63例腫瘤組織中有37例YAP在細胞核中高表達,和癌旁組織中YAP表達有明顯差異(P0.01);并且胞核YAP的表達和胰腺癌的病理分化程度相關,和性別、年齡、腫瘤大小、位置、TNM分期及臨床分期無明顯相關性。3.腫瘤組織中胞核YAP的高表達和不良預后呈正相關。結論:1.胰腺癌腫瘤組織中YAP高表達;并且胞核YAP的表達和病理分化程度相關。2.胰腺癌中胞核YAP表達可以作為預示胰腺癌術后不良預后的指標。并且將來有可能作為胰腺癌治療的一個新型潛在靶點。第二部分YAP基因在胰腺癌侵襲、遷移及血管生成中的作用及機制研究研究目的:體外實驗研究YAP在胰腺癌遷移、侵襲及血管生成的作用和機制。研究方法:1.選取常見五種胰腺癌細胞系(PANC-1、BxPC-3、SW1990、MiaPaCa-2、Panc 02.03)及正常胰腺導管上皮細胞(HPDE6),提取mRNA及總蛋白,用qRT-PCR及Western Blot的方法檢測YAP的表達水平;篩選出高表達YAP的細胞系用于后續(xù)實驗。2.胰腺癌細胞系PANC-1及BxPC-3分別轉染沉默質粒shYAP,篩選出穩(wěn)定細胞株;qRT-PCR及Western Blot檢測YAP表達水平;利用劃痕實驗及Transwell實驗檢測沉默YAP對胰腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響。3.利用 Western Blot 檢測沉默 YAP 對 EMT 相關蛋白 E-cadherin、Vimentin、Snail 及 MMP2、MMP13 的影響。4.選取人臍靜脈內皮細胞(HUVECs),分別沉默或過表達YAP;利用Transwell實驗和小管形成實驗,檢測YAP對血管生成能力的影響;Western Blot檢測血管生成素2(Ang2)表達。結果:1.胰腺癌細胞系中YAP的mRNA及蛋白表達水平明顯高于HPDE6。2.沉默表達載體shYAP可以有效抑制胰腺癌細胞中YAP的表達;沉默YAP可以抑制胰腺癌的遷移及侵襲能力。3.沉默 YAP 后 E-cadherin 表達水平升高,Vimentin、Snail、MMP2 及 MMP13表達水平降低。4.沉默YAP減弱HUVECs小管形成能力,過表達YAP增加了 HUVECs小管形成能力;且沉默YAP導致Ang2水平降低,過表達YAP誘導Ang2表達水平升高。結論:1.胰腺癌細胞系中YAP表達水平明顯升高。2.YAP可以通過EMT及MMPs途徑重塑腫瘤微環(huán)境,促進胰腺癌的遷移及侵襲。3.YAP通過調控Ang2的表達,影響胰腺癌的血管生成能力。第三部分缺氧誘導YAP核轉運導致Hippo通路失活促進胰腺癌的侵襲研究目的:本部分主要探討HIF-1α及YAP在胰腺癌組織中表達的相關性;并深入研究缺氧微環(huán)境影響胰腺癌侵襲能力及Hippo通路的分子機制。研究方法:1.檢測19例胰腺癌組織標本中HIF-1α的mRNA表達水平;采用Peαrson檢驗分析HIF-1α及YAP的mRNA表達水平間的相關性。2.通過劃痕實驗及Transwell實驗檢測缺氧對胰腺癌細胞遷移及侵襲能力的影響;qRT-PCR和Western Blot檢測EMT相關蛋白、MMP2及MMP13的表達水平。3.Western Blot檢測缺氧對Hippo通路相關蛋白影響;分別提取細胞核及細胞質中蛋白,檢測缺氧對YAP表達水平及部位影響;進一步通過激光共聚焦顯微鏡檢測HIF-1α和YAP蛋白的表達和定位。4.缺氧環(huán)境下,分別沉默HIF-1α及YAP,通過Transwell檢測對胰腺癌細胞侵襲能力影響;qRT-PCR和Western Blot檢測EMT相關蛋白、MMP2及MMP13的表達水平;Western Blot檢測Hippo通路相關蛋白變化。結果:1.胰腺癌組織中HIF-1α的mRNA高表達,并且和YAP的表達有相關性。2.缺氧增強了 PANC-1及BxPC-3的遷移及侵襲能力;缺氧條件下E-cadherin 表達減少,Snail、Vimentin、MMP2 及 MMP13 表達增加。3.缺氧條件下,HIF-1α表達增加,pYAP表達減少,TEAD表達增加;缺氧增加了胞核YAP/胞質YAP的比例。4.缺氧條件下,沉默HIF-1α或YAP抑制胰腺癌的侵襲;沉默HIF-1α或YAP 誘導 E-cadherin 表達增加,Snail、Vimentin、MMP2 及 MMP13 表達減少;沉默HIF-1α后Hippo通路蛋白表達無明顯變化,然而沉默YAP可以明顯抑制YAP、pYAP、TEAD 及 HIF-1α 的表達。結論:1.胰腺癌腫瘤組織中HIF-1α高表達,并且和YAP的mRNA水平呈正相關。2.缺氧通過調控EMT相關蛋白、MMP2及MMP13促進胰腺癌的侵襲。3.缺氧可以誘導YAP核轉運導致Hippo通路的失活。4.缺氧條件下,YAP可以轉錄激活HIF-1α表達,通過EMT及MMPs介導的腫瘤微環(huán)境重構,促進胰腺癌的侵襲。第四部分Hippo通路抑制劑維替泊芬誘導胰腺癌細胞凋亡和抑制血管生成的機制研究研究目的:通過體內外實驗研究Hippo通路抑制劑維替泊芬對胰腺癌細胞增殖、凋亡和血管生成的影響,并探索相關分子機制。研究方法:1.通過CCK-8實驗檢測不同濃度維替泊芬對胰腺癌細胞活力影響;通過流式細胞技術檢測維替泊芬對細胞周期影響;通過克隆形成實驗檢測維替泊芬對細胞增殖能力的影響。2.通過透射電鏡、TUNEL染色及流式細胞技術檢測維替泊芬對胰腺癌細胞凋亡的影響。3.Western Blot檢測不同濃度維替泊芬處理胰腺癌細胞后,對細胞周期蛋白cyclinD1 和 cyclinE1,凋亡相關蛋白 PARP、cleaved PARP、Bax 及 Bcl-2,Hippo通路YAP、pYAP及TEAD蛋白的影響。4.通過Transwell、小管形成實驗驗證維替泊芬對HUVECs的血管生成能力的影響,Western Blot檢測Ang2的表達。5.通過Transwell、小管形成實驗檢測維替泊芬對胰腺癌血管生成擬態(tài)的影響;Western Blot檢查血管擬態(tài)標記物VE-cadherin、α-SMA及MMP2的表達。6.裸鼠成瘤實驗驗證維替泊芬對胰腺癌皮下移植瘤細胞凋亡、血管形成及血管生成擬態(tài)的影響;免疫組化染色cyclinD1、cyclinE1、Ki67、Ang2、VE-cadherin、α-SMA、MMP2、CD31 等指標;TUNEL 染色檢測凋亡及 PAS/CD31雙染檢測血管生成擬態(tài)。研究結果:1.維替泊芬能夠抑制細胞存活,并呈時間及濃度依賴;維替泊芬還可以抑制細胞增殖,同時將胰腺癌細胞阻滯在G1期,減少S期細胞。2.維替泊芬可以誘導胰腺癌細胞凋亡。3.維替泊芬抑制細胞周期蛋白cyclinD1和cyclinE1,誘導凋亡相關蛋白cleavedPARP、及Bax表達增加,還可以抑制Hippo通路YAP、pYAP及TEAD蛋白的表達,呈濃度梯度依賴。4.維替泊芬可以抑制HUVECs的血管生成能力,也可以抑制胰腺癌細胞的血管生成擬態(tài);維替泊芬抑制了 Ang2、VE-cadherin、α-SMA及MMP2的表達。5.體內實驗證實維替泊芬處理組腫瘤瘤重、體積小于對照組;免疫組化示維替泊芬組 cyclinD1、cyclinE1、Ki67、Ang2、VE-cadherin、α-SMA、MMP2、CD31表達減少,血管擬態(tài)減少,凋亡指數(shù)增加。結論:1.維替泊芬可以抑制細胞增殖,將其阻滯在G1期,并誘導細胞凋亡。2.維替泊芬可以通過抑制YAP蛋白表達,調控細胞周期及凋亡相關蛋白表達。3.體內外實驗證實維替泊芬可以通過抑制Ang2表達,抑制血管生成;通過抑制VE-cadherin、α-SMA、MMP2表達影響腫瘤血管生成擬態(tài)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.9

【相似文獻】

相關期刊論文 前2條

1 趙修民;王德林;;YAP基因表達與腫瘤的關系[J];廣東醫(yī)學;2011年12期

2 ;[J];;年期

相關博士學位論文 前1條

1 尉洪龍;YAP基因在胰腺癌遷移、侵襲及血管生成中的作用和機制研究[D];山東大學;2017年

相關碩士學位論文 前1條

1 曹建佳;慢病毒介導的YAP基因沉默對腎癌細胞增殖和凋亡的影響[D];重慶醫(yī)科大學;2014年

，

本文編號：1508226