本文關(guān)鍵詞： 食管鱗癌 基因組結(jié)構(gòu)突變 染色體碎裂 BFB CDCA7　出處：《山西醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：癌癥基因組包含著不同的體細胞遺傳變異形式,從核苷酸水平的變異(包括點突變和小的插入/缺失)到染色體水平的結(jié)構(gòu)突變/結(jié)構(gòu)變異(structural mutations,SMs)/(structural variations,SVs)(包括染色體重排和拷貝數(shù)改變),其中某些可能是促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動突變。研究顯示,SVs可通過直接破壞抑癌基因的結(jié)構(gòu)和功能、造成重要癌基因的拷貝數(shù)增加、形成新的致瘤性融合基因等多種途徑促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此,全面鑒別腫瘤基因組中SVs區(qū)域、并對其中受累基因進行功能研究,是發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生中關(guān)鍵驅(qū)動基因的有力途徑。我國是食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)發(fā)病率及死亡率最高的國家,最近幾年里我們及其他學者已經(jīng)通過二代測序鑒定出了食管鱗癌中發(fā)生頻繁突變的驅(qū)動基因,包括諸如TP53、PIK3CA、NOTCH1、CDKN2A等明星基因,以及新的如ZNF750、AJUBA、FAT1等新的ESCC相關(guān)基因,并對關(guān)鍵基因的功能和機制做了深入研究,而覆蓋ESCC整個基因組的SVs及其機制、以及受SVs影響的關(guān)鍵基因仍未知。目的:基因組學水平分析食管鱗癌基因組結(jié)構(gòu)突變,包括染色體重排和拷貝數(shù)變異。繪制食管鱗癌結(jié)構(gòu)突變頻譜及發(fā)生機制頻譜,鑒定染色體碎裂、基因融合、BFB循環(huán)和kataegis等復雜結(jié)構(gòu)突變在食管鱗癌中的發(fā)生頻率及影響的靶基因;基于結(jié)構(gòu)突變篩選新的驅(qū)動食管鱗癌發(fā)生的基因,明確其表達水平變化及對食管鱗癌細胞增殖、侵襲及遷移能力的影響,并初步探討其作用機制。方法:1.從ega(europeangenome-phenomearchive)下載31例escc腫瘤及匹配正常食管組織的全基因組測序數(shù)據(jù),用生物信息學方法針對基因組結(jié)構(gòu)突變進行重新分析,繪制食管鱗癌結(jié)構(gòu)突變頻譜及發(fā)生機制頻譜,鑒定食管鱗癌中染色體碎裂、基因融合、bfb循環(huán)和kataegis等復雜結(jié)構(gòu)重排的頻率及受影響靶基因。2.fish技術(shù)驗證相應食管鱗癌標本中染色體碎裂導致的fgfr1和letm2擴增、bfb循環(huán)導致的ccnd1基因擴增;fish技術(shù)和pcrsanger測序檢測融合基因及轉(zhuǎn)錄本。3.免疫組織化學方法檢測食管鱗癌組織芯片中l(wèi)etm2蛋白表達情況;rnai干擾食管鱗癌細胞內(nèi)源性fgfr1和letm2,westernblot驗證基因干擾效率,mtt實驗、transwell實驗觀察對細胞增殖、侵襲和遷移的影響。4.patchwork和gistic方法聯(lián)合分析31例escc全基因組測序數(shù)據(jù)和123例cgh數(shù)據(jù),鑒定食管鱗癌全基因組拷貝數(shù)變異特征及區(qū)域,進一步從中篩選食管鱗癌發(fā)生的新驅(qū)動基因。5.采用rt-pcr和基于組織芯片的免疫組織化學方法檢測食管鱗癌組織及正常食管粘膜組織中cdca7mrna和蛋白表達差異;rnai干擾內(nèi)源性cdca7水平,westernblot驗證基因干擾效率,mtt實驗、transwell實驗、流式細胞實驗觀察對食管鱗癌細胞增殖、侵襲、遷移和細胞凋亡的影響。6.rnaseq檢測穩(wěn)定敲低cdca7后基因表達差異,篩選與細胞增殖和凋亡相關(guān)的差異表達基因,繪制cdca7影響食管鱗癌細胞增殖和凋亡的靶通路;westernblot驗證靶通路表達水平。結(jié)果:1.31個escc基因組中共發(fā)現(xiàn)5204個結(jié)構(gòu)突變,平均每例包含168個;觀察到缺失、末端復制、倒位、插入和染色體易位5個突變類型,其中染色體易位和缺失是escc中的主要結(jié)構(gòu)突變類型,分別占比42%和35%。2.造成escc中結(jié)構(gòu)突變的主要機制是nhej和alt-ej。3.3376個結(jié)構(gòu)突變發(fā)生在基因區(qū),并直接破壞基因序列;結(jié)構(gòu)突變造成了escc中重要腫瘤抑制基因cdkn2a(13/31)和notch1(2/31)基因的缺失或失活。4.31例escc中發(fā)現(xiàn)了1例染色體碎裂,導致染色體8p12的高度擴增,fish實驗驗證了該區(qū)域包含的fgfr1和letm2擴增是由于染色體碎裂伴隨的dms形成所導致;免疫組化結(jié)果顯示letm2蛋白在escc腫瘤組織中過表達;rnai、mtt、transwell等實驗發(fā)現(xiàn)fgfr1促進食管鱗癌細胞增殖、侵襲和遷移,letm2促進食管鱗癌細胞增殖,但對侵襲和遷移無影響。5.31例escc基因組中共鑒定出了173個框內(nèi)融合基因和231個不符合讀碼框架的融合基因;通過分析參與融合事件的基因功能以及融合事件對基因結(jié)構(gòu)的影響,篩選出了可能在escc發(fā)生發(fā)展過程中起驅(qū)動作用的trappc9-clvs1、eif3e-rad51b融合基因;fish驗證了基因組水平融合事件、pcrsanger測序驗證了在相應食管鱗癌組織中存在融合基因轉(zhuǎn)錄本。6.在escc-14t的3號染色體局灶(范圍16.9-17.5mb)集中了大量染色體重排,同時發(fā)生了成簇的核苷酸突變,并且高度突變區(qū)域內(nèi)的突變以tpcpx三核苷酸中的ct顛換為主,提示kataegis在escc中具有潛在致瘤作用。7.bfb循環(huán)是escc中導致癌基因擴增的重要機制,31例escc中共有21例發(fā)生了bfb,其中9例導致ccnd1擴增,其余分別導致egfr、erbb2、mmps和myc等癌基因擴增;fish結(jié)果證實ccnd1信號在等位基因區(qū)域呈現(xiàn)不平衡狀態(tài);另外,ccnd1所在的11號染色體富集了染色體間svs,提示ccnd1在escc中擴增機制至少有兩種。8.對31例escc的拷貝數(shù)變異分析發(fā)現(xiàn),其中19例可以判斷出絕對拷貝數(shù);其中包含著頻繁的3q、5p、7p、8q、12p、17p、20p、20q的拷貝數(shù)擴增和3p、4p、4q、5q、10p、13q、21q拷貝數(shù)缺失;escc中70%的雜合性缺失是拷貝數(shù)中立的雜合性缺失,以13q和17p為著;31例escc中有13例存在wgd現(xiàn)象,提示cn-loh和wgd可能對escc發(fā)生發(fā)展具有重要意義。9.應用gistic分析31例escc的全基因組測序數(shù)據(jù)和123例escc的cgh數(shù)據(jù),鑒定出了11個擴增峰和13個缺失峰,包括egfr、cdk6、akt1、myc、ccnd1和cdkn2a等已知在escc中存在拷貝數(shù)變異基因所在區(qū)域。10.鑒定出了escc基因組中新的高度擴增區(qū)域——2q31,rt-pcr和ihc結(jié)果證實其中的靶基因cdca7在食管鱗癌組織中表達增高(p0.001)。11.穩(wěn)定敲低ECA109細胞中CDCA7水平明顯抑制細胞增殖、促進細胞凋亡(p0.05),但對細胞侵襲和遷移無影響,提示CDCA7是ESCC細胞增殖和凋亡相關(guān)基因。12.RNA-seq顯示穩(wěn)定敲低CDCA7后,FGF21、CASP10、IL1R1、CASP7、BCL2、CASP9、TRAIL-R等增殖和凋亡相關(guān)基因表達差異;Western blot實驗顯示敲低CDCA7后pERK1/2水平降低;DAVID繪制差異基因功能通路,提示CDCA7可能通過調(diào)節(jié)FGF21-ERK1/2-MAPK通路發(fā)揮促增殖和抗凋亡的作用。結(jié)論:1.食管鱗癌基因組中存在著大量結(jié)構(gòu)突變,包括缺失、末端復制、倒位、插入和染色體易位5種類型,其中以缺失和染色體易位為主。2.染色體碎裂、Kataegis和BFB等復雜結(jié)構(gòu)重排在食管鱗癌中具有一定發(fā)生頻率,并導致FGFR1、LETM2、CCND1等癌基因的擴增和潛在致癌融合基因TRAPPC9-CLVS1、EIF3E-RAD51B形成。3.拷貝數(shù)中立的雜合性缺失和全基因組復制普遍存在是食管鱗癌拷貝數(shù)變異的特征,可能對食管鱗癌發(fā)生發(fā)展具有重要意義。4.CDCA7基因是通過拷貝數(shù)變異分析篩選出的新的食管鱗癌相關(guān)基因,在食管鱗癌中發(fā)生拷貝數(shù)擴增和過表達,促進食管癌細胞增殖、抑制其凋亡,可能是新的食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動基因。
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【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
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本文編號：1500841