本文關(guān)鍵詞： 結(jié)直腸癌 ALDH1A1 CD44v6 Lgr5 Nanog PTEN-Long　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。2015年最新統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,美國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率在男性和女性中均高居第三位。在我國(guó),隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。近年來隨著癌癥研究的深入,結(jié)直腸癌診斷和治療取得了很大進(jìn)展,但結(jié)直腸癌的死亡率仍居高不下,給人類的健康帶來嚴(yán)重危害。因此,深入開展結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究,尋找新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物具有非常重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。腫瘤干細(xì)胞理論是新近提出的一個(gè)理論。該理論認(rèn)為,腫瘤內(nèi)部存在著由少量細(xì)胞構(gòu)成的亞群,具有自我更新和多向分化潛能,從而使腫瘤具有了異質(zhì)性和高轉(zhuǎn)移性等特性,這類細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞。很多學(xué)者就腫瘤干細(xì)胞理論進(jìn)行了相關(guān)研究,但目前仍面臨諸多挑戰(zhàn)。目前用于實(shí)體腫瘤的標(biāo)志物紛繁復(fù)雜,沒有一個(gè)明確的特異性標(biāo)志物可以將腫瘤干細(xì)胞分離鑒定。此外,這些標(biāo)志物的證據(jù)多來自于細(xì)胞系和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),缺乏人體腫瘤組織的證據(jù)。這些標(biāo)志物在結(jié)直腸癌演進(jìn)過程中的表達(dá)情況如何,是否可以作為結(jié)直腸癌預(yù)后標(biāo)志物,目前還無明確定論。我們選取了的ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和Nanog四個(gè)標(biāo)志物進(jìn)行研究。抑癌基因PTEN在腫瘤干細(xì)胞中亦發(fā)揮重要功能。有研究發(fā)現(xiàn)BMP4或胸腺素β4在抑制結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞致瘤性并誘導(dǎo)其分化的過程中PTEN表達(dá)上調(diào)。PTEN-Long是抑癌基因PTEN的同型蛋白,于2013年在Science最先被報(bào)道,此后陸續(xù)有幾篇報(bào)道。PTEN基因編碼55kd PTEN和75kd PTEN-Long兩種蛋白。PTEN-Long是一段較長(zhǎng)的蛋白質(zhì)序列,由PTEN起始密碼子ATG上游的CTG起始編碼,在乳腺癌組織中可以檢測(cè)到PTEN-Long的表達(dá)。在人乳腺癌及腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中過表達(dá)PTEN-Long后可以抑制P13K信號(hào)通路的活性,進(jìn)而抑制了細(xì)胞增殖,與PTEN的作用機(jī)制相似. PTEN-Long還具有信號(hào)肽前導(dǎo)序列,從細(xì)胞內(nèi)分泌后,可進(jìn)入到其他細(xì)胞發(fā)揮抑癌功能。此項(xiàng)里程碑式的研究引起了我們的興趣,我們?cè)噲D研究PTEN-Long在結(jié)直腸癌中所發(fā)揮的功能。本論文研究旨在探討候選腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和 Nanog在結(jié)直腸癌演進(jìn)中表達(dá)的臨床意義及PTEN同型蛋白PTEN-Long在結(jié)直腸癌中的功能。1.ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和Nanog在結(jié)直腸癌演進(jìn)中的表達(dá)及臨床意義我們運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)結(jié)直腸組織中的ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和Nanog表達(dá),研究對(duì)象為兩組獨(dú)立的樣本。第一組為419例結(jié)直腸癌芯片(tissue microarray,TMA)樣本,分析四指標(biāo)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及對(duì)預(yù)后的影響。第二組為常規(guī)病理切片樣本,包括了217例腺瘤樣本(105例低級(jí)別腺瘤和112例高級(jí)別腺瘤),72例腸原發(fā)灶和對(duì)應(yīng)肝轉(zhuǎn)移灶的樣本,基于結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子模型,系統(tǒng)研究四指標(biāo)在正常黏膜-腺瘤-腸癌原發(fā)灶-肝轉(zhuǎn)移灶發(fā)展過程中的表達(dá)變化趨勢(shì)。為了驗(yàn)證ALDH1A1研究結(jié)果的可靠性,我們?cè)诔Ｒ?guī)病理切片組增加了193例結(jié)直腸癌樣本。1),ALDH1A1在結(jié)直腸癌演進(jìn)中的表達(dá)及臨床意義結(jié)直腸組織ALDH1A1不僅在細(xì)胞漿中陽(yáng)性表達(dá),細(xì)胞核中亦有陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)直腸癌的演進(jìn)過程中,ALDH1A1在低級(jí)別腺瘤中表達(dá)最強(qiáng),高級(jí)別腺瘤、腸原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)下調(diào),且后三者表達(dá)無差異[低級(jí)別腺瘤(高級(jí)別腺瘤=腸原發(fā)灶=肝轉(zhuǎn)移灶)]。另我們?cè)谀c癌和肝轉(zhuǎn)移灶中亦觀察到ALDH1A1間質(zhì)陽(yáng)性,且細(xì)胞核陽(yáng)性樣本常伴隨間質(zhì)陽(yáng)性,兩者存在正相關(guān)。Kaplan-Meier單因素生存分析提示ALDH1A1在細(xì)胞漿的表達(dá)與結(jié)直腸癌的預(yù)后無關(guān),而ALDH1A1細(xì)胞核陽(yáng)性與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān),且核陽(yáng)患者預(yù)后較好。COX多因素生存分析提示ALDH1A1核陽(yáng)為獨(dú)立預(yù)后因素。2), CD44v6在結(jié)直腸癌演進(jìn)中的表達(dá)及臨床意義CD44v6在結(jié)直腸組織中的定位為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。結(jié)直腸癌演進(jìn)過程中,CD44v6在腺瘤中表達(dá)最強(qiáng),原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶表達(dá)較低。低級(jí)別腺瘤與高級(jí)別腺瘤表達(dá)無差異,原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)無差異[正常黏膜(低級(jí)別腺瘤=高級(jí)別腺瘤)原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶]。我們還觀察到CD44v6在腸癌前緣的表達(dá)水平均較中央?yún)^(qū)低。Kaplan-Meier單因素生存分析提示CD44v6表達(dá)與預(yù)后無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系,但處于臨界水平。CD44v6低表達(dá)患者預(yù)后相對(duì)高表達(dá)患者差,與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者CD44v6表達(dá)低結(jié)果一致。Spearman相關(guān)性分析提示CD44v6表達(dá)與E-cadherin表達(dá)呈明顯正相關(guān)。3),Lgr5在結(jié)直腸癌演進(jìn)中的表達(dá)及臨床意義Lgr5在結(jié)直腸組織中的定位為細(xì)胞膜和細(xì)胞漿。結(jié)直腸癌演進(jìn)過程中,Lgr5在高級(jí)別腺瘤中表達(dá)最強(qiáng),低級(jí)別腺瘤次之,原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶表達(dá)再次之,正常黏膜最低,且原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)無差異[正常黏膜(低級(jí)別腺瘤高級(jí)別腺瘤)原發(fā)灶和肝轉(zhuǎn)移灶]。Lgr5的表達(dá)與腸癌發(fā)生部位、組織學(xué)分級(jí)、浸潤(rùn)深度存在相關(guān)性,直腸、低級(jí)別腸癌和浸潤(rùn)深度較淺者Lgr5表達(dá)較高。Kaplan-Meier單因素生存分析提示Lgr5高表達(dá)患者預(yù)后較好,COX多因素生存分析提示Lgr5為獨(dú)立預(yù)后因素。Lgr5的表達(dá)與核β-catenin的表達(dá)無關(guān)。4), Nanog在結(jié)直腸癌演進(jìn)中的表達(dá)及臨床意義本研究中Nanog在結(jié)直腸組織中的定位為細(xì)胞漿而非細(xì)胞核。結(jié)直腸癌的演進(jìn)過程中,Nanog在高級(jí)別腺瘤中的表達(dá)強(qiáng)于低級(jí)別腺瘤,腸原發(fā)灶中的表達(dá)強(qiáng)于肝轉(zhuǎn)移灶(正常黏膜低級(jí)別腺瘤高級(jí)別腺瘤腸癌原發(fā)灶肝轉(zhuǎn)移灶)。Nanog的表達(dá)與腸癌發(fā)生部位、組織學(xué)分級(jí)和浸潤(rùn)深度存在相關(guān)性,直腸、低級(jí)別腸癌和浸潤(rùn)深度較淺的患者Nanog的表達(dá)較高。Kaplan-Meier單因素生存分析提示Nanog高表達(dá)患者預(yù)后較好,COX多因素生存分析提示Nanog為獨(dú)立預(yù)后因素。5),四指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)直腸癌中ALDH1A1的表達(dá)與Lgr5、Nanog的表達(dá)均無相關(guān)性。雖然CD44v6的表達(dá)與ALDH1A1、Lgr5、Nanog的表達(dá)均有相關(guān)性,但因其表達(dá)廣泛,故臨床應(yīng)用價(jià)值不大.Lgr5和Nanog在腺瘤-腸原發(fā)灶-肝轉(zhuǎn)移灶的發(fā)展進(jìn)程中表達(dá)一致,具有正相關(guān)關(guān)系.Lgr5和N anog聯(lián)合分析后發(fā)現(xiàn)Nanog+Lgr5+樣本組與Nanog-Lgr5-組相比預(yù)后較好。6),基于預(yù)后指數(shù)的死亡風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型建立及其預(yù)后價(jià)值我們采用隨機(jī)化原則,隨機(jī)選擇80%TMA樣本作為訓(xùn)練集,建立預(yù)后模型。20%樣本作為驗(yàn)證集,對(duì)所建模型進(jìn)行驗(yàn)證。在訓(xùn)練集樣本中,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、Lgr5表達(dá)和β-catenin入核情況具有獨(dú)立預(yù)后意義。我們基于這4個(gè)因素計(jì)算預(yù)后指數(shù)(P rognostic Index, PI),與TNM分期相比,PI在判斷結(jié)直腸癌患者1、3和5年生存情況時(shí)準(zhǔn)確性更高。我們最終建立了以PI為變量的1、3和5年死亡風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型,可以評(píng)估每個(gè)個(gè)體的生存情況,并且該模型在驗(yàn)證集中得到較好驗(yàn)證。2. PTEN-Long在結(jié)直腸癌中的功能研究我們運(yùn)用商品化的PTEN抗體在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞系中檢測(cè)到PTEN和少量PTEN-Long的表達(dá),說明機(jī)體內(nèi)存在交替翻譯的現(xiàn)象。隨后我們采用基因合成的方法獲取以CTG作為起始密碼子的PTEN-Long全長(zhǎng)序列,構(gòu)建入p3×FLAG-CMVTM-14表達(dá)載體中,得到PTEN-Long-CTG/ATG表達(dá)載體。為使PTEN-Long高效翻譯,我們?cè)贑TG/ATG表達(dá)載體的基礎(chǔ)上,將起始密碼子CTG突變?yōu)锳TG,構(gòu)建了PTEN-Long-ATG/ATG表達(dá)載體。將兩種載體分別轉(zhuǎn)染入不表達(dá)PTEN的293FT細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)PTEN-Long ATG/ATG及PTEN-Long CTG/ATG在75kd處均有表達(dá),但ATG/ATG較 CTG/ATG的表達(dá)量要高,提示這兩種密碼子被識(shí)別的效率不同,ATG為主導(dǎo)起始密碼子,而CTG為次要起始密碼子,與機(jī)體內(nèi)的狀態(tài)相吻合。有趣的是,在ATG/ATG組亦檢測(cè)到少量外源55kdPTEN的表達(dá),這與過表達(dá)載體默認(rèn)第二個(gè)ATG僅作為蛋氨酸存在的原理相悖,提示當(dāng)外源轉(zhuǎn)染表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞時(shí),同樣存在不同起始密碼子交替翻譯的現(xiàn)象。我們還針對(duì)PTEN-Long的抗原表位,制備出了PTEN-Long特異性的兔多克隆抗體,因是多克隆抗體,效價(jià)較低,僅在PTEN-Long過量表達(dá)時(shí)驗(yàn)證了抗體的有效性。我們?cè)贒LD1, SW480, RKO三株腸癌細(xì)胞系中過表達(dá)PTEN-Long-ATG/ATG,篩選單克隆細(xì)胞株。同293FT細(xì)胞一致,在RKO細(xì)胞系中亦觀察到交替翻譯的現(xiàn)象。對(duì)篩選到過表達(dá)PTEN-Long的DLD1、SW480和RKO單克隆細(xì)胞株進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)PTEN-Long可以抑制腸癌細(xì)胞的遷移。綜合以上對(duì)ALDH1A1、CD44v6、 Lgr5、Nanog和PTEN-Long在結(jié)直腸癌中的研究,我們得出以下結(jié)論：(1)ALDH1A1、CD44v6、Lgr5和Nanog可作為結(jié)直腸癌預(yù)后的分子標(biāo)志物,各指標(biāo)高表達(dá)預(yù)后較好,其中ALDH1A1核陽(yáng)、Lgr5和Nanog為獨(dú)立預(yù)后因素.Nanog和Lgr5聯(lián)合分析可以提高預(yù)后價(jià)值,Nanog-Lgr5-結(jié)直腸癌患者預(yù)后最差。基于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、Lgr5表達(dá)和β-catenin入核情況建立的以PI為變量的1、3和5年死亡風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型在判斷結(jié)直腸癌患者1、3和5年生存情況時(shí)具有較好的準(zhǔn)確性,實(shí)現(xiàn)了個(gè)體化生存預(yù)測(cè)。(2) PTEN-Long為經(jīng)典PT EN的同型蛋白質(zhì),兩者在機(jī)體內(nèi)存在交替翻譯現(xiàn)象,且PTEN-Long在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Expression of proliferating cell nuclear antigen and CD44 variant exon 6 in primary tumors and corresponding lymph node metastases of colorectal carcinoma with Dukes'stage C or D[J];World Journal of Gastroenterology;2003年07期

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本文編號(hào)：1499190