本文關(guān)鍵詞： 上皮性卵巢癌 Dicer 雙向電泳和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè) PDIA3 microRNA　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的RNAaseⅢ家族核糖核酸內(nèi)切酶Dicer在上皮性卵巢癌中低表達(dá)并且與疾病的進(jìn)展和生存期短相關(guān)。本研究旨在探究上皮性卵巢癌細(xì)胞中Dicer低表達(dá)所引起的蛋白組學(xué)改變,并尋找Dicer下游關(guān)鍵靶蛋白,以明確Dicer調(diào)控卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機(jī)制。方法1.構(gòu)建特異性靶向沉默Dicer基因的短發(fā)卡RNA (shDicer)質(zhì)粒,并連入慢病毒質(zhì)粒載體。shDicer轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780, CAOV3和SKOV3,構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)Dicer的卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染株。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(WB)檢測(cè)三組細(xì)胞系中Dicer表達(dá)的下調(diào)效率。EdU增殖實(shí)驗(yàn),Wound-healing和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)Dicer表達(dá)后,卵巢癌細(xì)胞的惡性增殖和遷移能力的變化。3.雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE)技術(shù)檢測(cè)上皮性卵巢癌細(xì)胞CAOV3-shNC和CAOV3-shDicer蛋白表達(dá),并從中挑選出變化最為顯著的蛋白點(diǎn)(表達(dá)差異大于2倍)使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)檢測(cè),同時(shí)利用qRT-PCR和WB對(duì)這些蛋白點(diǎn)的差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證�；诓町惐磉_(dá),蛋白功能以及蛋白間相互作用分析,我們篩選出Dicer下游關(guān)鍵蛋白PDIA3。Targetscan軟件預(yù)測(cè),能夠特異性結(jié)合并且調(diào)控PDIA3表達(dá)的microRNAs為miR-148a和miR-494,同時(shí),qRT-PCR檢測(cè)niR-148a和miR-494在Dicer低表達(dá)的細(xì)胞株中的表達(dá)水平。4.構(gòu)建兩個(gè)靶向沉默PDIA3基因的小干擾RNA (siRNA),轉(zhuǎn)染穩(wěn)定下調(diào)Dicer的上皮性卵巢癌細(xì)胞A2780、CAOV3和SKOV3。qRT-PCR和WB檢測(cè)PDIA3的敲除效率。EdU增殖實(shí)驗(yàn),Wound-healing和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)下調(diào)PDIA3對(duì)Dicer沉默后引起卵巢癌細(xì)胞惡性增殖,遷移能力改變的影響。5.建立卵巢癌裸鼠皮下瘤模型,每組5只裸鼠,共五組。分別為SKOV3-shNC, SKOV3-shDicer、SKOV3-shDicer+siPDIA3-1、SKOV3-shDicer+siPDIA3-2和 SKOV3-shDicer+5%Glucose.每?jī)商鞙y(cè)量一次皮下瘤的大小并觀察記錄裸鼠一般情況(體重和飲食量)。6.裸鼠處死后,取出皮下瘤,一部分液氮保存,另一部分石蠟包埋。qRT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤中PDIA3、miR-148a和miR-494的表達(dá)量以及皮下瘤組織切片中增殖標(biāo)志物Ki-67,腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)途徑上皮表型E-cadherin和間質(zhì)表型Vimentin的表達(dá)水平。結(jié)果1. A2780, CAOV3和SKOV3轉(zhuǎn)染shDicer后Dicer的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均下降了60-70%。與對(duì)照組(轉(zhuǎn)染shNC的卵巢癌細(xì)胞)相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shDicer的卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移能力均明顯增強(qiáng)。2.雙向電泳結(jié)果顯示與CAOV3-shNC相比,CAOV3-shDicer細(xì)胞中的蛋白數(shù)量明顯較多(294±7 VS 422±70,p=0.0132)。經(jīng)過PDQuest軟件分析后,挑選出表達(dá)量改變大于2倍蛋白中表達(dá)差異最明顯的30個(gè)蛋白點(diǎn)做LC-MS/MS鑒定,除去未成功鑒定的和重復(fù)的蛋白點(diǎn),最后共得到26個(gè)有意義的蛋白。3.String 10蛋白相互作用分析數(shù)據(jù)庫和DAVID蛋白功能分析網(wǎng)站解析了26個(gè)蛋白點(diǎn)與Dicer之間的相互關(guān)系；最終挑選出了7個(gè)與Dicer存在相互作用并且在卵巢癌生物學(xué)進(jìn)展中起著重要作用的靶蛋白。qRT-PCR和WB進(jìn)一步驗(yàn)證了在下調(diào)Dicer的三株卵巢癌細(xì)胞中這7個(gè)靶蛋白的表達(dá)量改變,經(jīng)過對(duì)蛋白表達(dá)量的變化和蛋白功能的分析,我們得出PDIA3蛋白最有可能成為Dicer下游的關(guān)鍵靶蛋白,并且沉默Dicer表達(dá)后,卵巢癌細(xì)胞A2780,CAOV3和SKOV3中PDIA3的表達(dá)水平升高,而miR-148a和miR-494的表達(dá)顯著降低。4.沉默PDIA3表達(dá)后,下調(diào)Dicer的卵巢癌細(xì)胞A2780,CAOV3和SKOV3的增殖和遷移能力受到明顯抑制。裸鼠在體試驗(yàn)顯示下調(diào)Dicer的卵巢癌細(xì)胞組移植瘤體積明顯大于相應(yīng)對(duì)照組,同時(shí)轉(zhuǎn)染了siPDIA3的低表達(dá)Dicer卵巢癌細(xì)胞組移植瘤的體積明顯小于對(duì)照的低表達(dá)Dicer細(xì)胞組。5.qRT-PCR和免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示Dicer低表達(dá)組中PDIA3表達(dá)水平升高,miR-148a和miR-494的表達(dá)水平降低；同時(shí)增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)信號(hào)增強(qiáng),EMT途徑相關(guān)上皮表型E-cadherin表達(dá)顯著降低而間質(zhì)表型Vimentin的表達(dá)明顯增多；同時(shí)轉(zhuǎn)染siPDIA3的低表達(dá)Dicer組中,Dicer下調(diào)的卵巢癌細(xì)胞移植瘤中PDIA3表達(dá)量減少,同時(shí)增殖標(biāo)志物Ki-67的表達(dá)水平也降低,EMT途徑間質(zhì)表型Vimentin表達(dá)降低,而上皮表型E-cadherin表達(dá)水平獲得升高。結(jié)論低表達(dá)Dicer通過影響nicroRNAs的表達(dá),介導(dǎo)PDIA3表達(dá)上調(diào)從而促進(jìn)了上皮性卵巢癌細(xì)胞惡性增殖和遷移行為。
[Abstract]:Objective To investigate the expression of dicer in epithelial ovarian cancer cell line by double - dimensional electrophoresis ( RT - PCR ) and Western blot ( WB ) . Compared with the control group ( transfected with shNC ovarian cancer cells ) , the proliferation and migration of ovarian cancer cells stably transfected with shDicer were significantly increased . The expression level of PDIA3 in ovarian cancer cells was significantly lower than that of control group . The expression level of PDIA3 in ovarian cancer cells was significantly lower than that of control group .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：1498218