本文關(guān)鍵詞： 栝樓 葫蘆素B 三氧化二砷(ATO) Burkitt’s淋巴瘤　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的三氧化二砷(ATO),是砒霜的重要組成成分,在中國已經(jīng)被使用了兩千多年。20世紀(jì)70年代ATO被我國學(xué)者首先用于治療復(fù)發(fā)性和難治性急性早幼粒細胞性白血病(APL)。ATO是一個經(jīng)典的細胞凋亡誘導(dǎo)劑,雖然在在急性早幼粒細胞白血病治療中療效顯著,但ATO在淋巴瘤中的治療作用仍然是有限的,這可能與淋巴瘤不恰當(dāng)?shù)男盘柾返募せ罴暗蛲瞿褪苡嘘P(guān),如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子3(STAT3)及抗凋亡蛋白Bcl-2高表達等。以前的研究表明葫蘆素B(Cucurbitacin B,Cu B)是一種有效的STAT3抑制劑,在多種腫瘤中展現(xiàn)出強大的抗腫瘤效應(yīng)。Huang等研究顯示STAT3的激活與彌漫大B淋巴瘤的預(yù)后不良密切相關(guān)。因此我們猜想,葫蘆素可以通過抑制STAT3磷酸化增強ATO在淋巴瘤中的作用,改善淋巴瘤的凋亡耐受。ATO和Cu B的合用在淋巴瘤中至今還未被嘗試過。結(jié)合相關(guān)研究背景和現(xiàn)狀,我們決定探索中藥栝樓對淋巴瘤細胞的作用,并探索其有效成分是否為Cu B,同時探索Cu B是否可以在體內(nèi)外協(xié)同增強ATO的抗淋巴瘤作用。最后進一步研究Cu B聯(lián)合ATO抑制淋巴瘤的作用機制是否為Cu B抑制了STAT3磷酸化。材料與方法1.栝樓粗提物(TKE)對Burkitt’s淋巴瘤Ramos細胞增殖,凋亡和周期的影響:培養(yǎng)Burkitt淋巴瘤細胞株Ramos細胞和乳腺癌細胞MCF-7細胞,分別加入不同濃度梯度的TKE培養(yǎng)48h,臺盼藍拒染實驗觀察不同濃度的TKE對兩種細胞增殖的影響;設(shè)置不同濃度的TKE劑量組(2.5ug/ml TKE,5ug/ml TKE和空白對照組),FCM檢測Ramos細胞在0h,12h,24h的凋亡情況;FCM檢測Ramos細胞周期阻滯情況。2.使用高效液相色譜指紋圖譜技術(shù)(HPLC)證實Cu B是否為栝樓的有效成分。3.Cu B對Ramos細胞增殖及凋亡,周期的影響:培養(yǎng)Ramos細胞,加入不同濃度的Cu B,臺盼藍拒染實驗觀察細胞增殖;FCM檢測48h后的細胞凋亡率和周期分布。4.Cu B和ATO合用對淋巴瘤細胞增殖的影響:傳代培養(yǎng)Ramos、G519兩種淋巴瘤細胞。設(shè)不同濃度藥物Cu B(1,2.5,5 nmol/L)和ATO(0.5,1,2μmol/L)單用及合用組劑量組,共培養(yǎng)24小時,MTS法檢測Cu B聯(lián)合ATO對兩種細胞增殖的影響。5.Cu B和ATO合用對淋巴瘤細胞凋亡的影響:傳代培養(yǎng)Ramos、G519兩種淋巴瘤細胞。每種細胞加入1 umol/L ATO和5 nmol/L Cu B。FCM法檢測Ramos、G519兩種細胞的凋亡情況,Western blot檢測細胞凋亡蛋白酶caspase8,9,3的變化。6.Cu B和ATO合用的抗腫瘤作用機制的研究:通過Western blot檢測了經(jīng)Cu B和ATO單獨及聯(lián)合處理后,Ramos細胞內(nèi)一些信號通路蛋白P-STAT3、P-Erk1/2、bcl-2、Bax表達水平的變化。7.Cu B和ATO合用的體內(nèi)抗腫瘤作用研究:以Ramos細胞注入裸鼠體內(nèi)建立淋巴瘤裸鼠移植瘤模型。設(shè)空白對照組,Cu B單藥組,ATO單藥組,Cu B與ATO合用組,給藥20天后處死小鼠,計算抑瘤率。免疫組化檢測PCNA,STAT3的表達情況;TUNEL法檢測淋巴瘤細胞原位凋亡情況。結(jié)果1.栝樓粗提物(TKE)對Burkitt’s淋巴瘤Ramos細胞增殖,凋亡,周期的影響TKE能以時間與劑量依賴性的方式抑制Ramos細胞增殖;TKE明顯誘導(dǎo)Ramos細胞凋亡,在2.5μg/m L或5μg/m L TKE處理24 h后,TKE能以時間和劑量依賴性的方式誘導(dǎo)Ramos細胞凋亡;在24 h時,2.5和5μg/m L TKE組Ramos細胞的凋亡率的分別為33.93(±8.52)%,和71.33(±16.49)%(P0.05)。通過凋亡檢測散點圖可以觀察到,在12 h和24 h之間,細胞呈現(xiàn)出一個明顯從早期凋亡到晚期凋亡的動態(tài)過渡。細胞周期結(jié)果顯示,TKE能誘導(dǎo)Ramos細胞組滯在G1期。2.Cu B:栝樓是活性成分之一通過分析,TKE在310 nm紫外線的保留時間是30.478s。高效液相色譜指紋圖譜顯示的Cu B在310 nm的保留時間為30.395分鐘。因為保留時間的范圍的偏差在±2.5%,所以它可以證實,Cu B是栝樓活性成分之一。3.Cu B對Burkitt淋巴瘤Ramos細胞增殖,凋亡,周期的影響臺盼藍染色細胞計數(shù)結(jié)果顯示,2.5 nmol/L和5 nmol/L Cu B能呈時間和濃度依賴性地方式抑制Ramos細胞增殖。細胞凋亡檢測的結(jié)果顯示Cu B對Ramos細胞有明顯的凋亡誘導(dǎo)作用。Ramos細胞的凋亡率在10 nmol/L Cu B處理后24h高達64.4(±13.4)%(P0.05)。細胞凋亡散點圖顯示24 h時,大量的細胞進入細胞晚期凋亡。在細胞周期檢測中,Ramos細胞經(jīng)10 nmol/L Cu B處理后顯示出S期阻滯。4.Cu B與ATO聯(lián)合應(yīng)用的體外抗淋巴瘤作用4.1藥物聯(lián)合實驗果表明,低劑量的Cu B與ATO聯(lián)合使用時,Cu B能以協(xié)同地方式大大增強了ATO對Ramos細胞的增殖抑制作用,但沒有提高ATO對G519細胞的影響。4.2細胞凋亡檢測顯示,聯(lián)合治療組(ATO+Cu B)的細胞凋亡率高于Cu B或ATO單獨作用。在G519細胞中,無明顯協(xié)同作用。Western blot結(jié)果顯示凋亡蛋白酶caspase8,9,3有明顯的裂解,表明Cu B和ATO可同時通過內(nèi)源性和外源性凋亡通路誘導(dǎo)細胞凋亡。4.3在聯(lián)合作用機制上,Western blot顯示,經(jīng)Cu B和ATO聯(lián)合處理后Ramos細胞內(nèi)P-STAT3和P-Erk1/2水平下降,總STAT3和Erk沒有顯著改變。進一步檢測STAT3和Erk的下游靶標(biāo)水平,發(fā)現(xiàn)抗凋亡蛋白bcl-2表達下調(diào),促凋亡蛋白Bax上調(diào)。5.Cu B和ATO合用的體內(nèi)抗腫瘤作用為了進一步證實葫蘆素與ATO合用的抗淋巴瘤作用,Ramos淋巴瘤移植瘤模型被建立。設(shè)立生理鹽水(NS)組,Cu B單藥組,ATO單藥作用,Cu B與ATO合用藥組。經(jīng)過20天腹腔給藥,結(jié)果顯示,Cu B與ATO合用組瘤塊平均體積減小,小于對照組和Cu B和ATO單用組。每組的平均瘤重為1.34±0.47g,1.20±0.69g,0.73±0.57g,0.25±0.22g,合用組抑瘤率達到85.6%。結(jié)論:1.Cu B是栝樓的活性成分之一。2.Cu B在Burkitt’s淋巴瘤中具有強大抗淋巴瘤作用。3.Cu B在體內(nèi)和體外實驗中均顯示出能協(xié)同增強ATO的抗淋巴瘤作用。4.Cu B是通過抑制STAT3磷酸化來協(xié)同增強ATO的抗淋巴瘤作用。5.Cu B可以成為未來淋巴瘤治療中的一種聯(lián)合用藥的理想選擇。
[Abstract]:Objective To study the effect of Cu - B combined with ATO on the proliferation , apoptosis and cycle of lymphoma cells . The effects of TKE on proliferation , apoptosis and cycle of Ramos cells were detected by Western blot . The results showed that Cu - B inhibited the proliferation of Ramos cells at 24 h after treatment with 10 nmol / L Cu B . 1 . Cu - B is one of the active components of trichosanthes kirilowii . 2 . Cu - B has a strong anti - lymphoma effect in Burkitt ' s lymphoma .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.1
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本文編號：1494851