本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞肝癌 蛋白質(zhì)組學(xué) 雙向熒光差異凝膠電泳 氨基酰化酶1 細(xì)胞侵襲　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景： 肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之 我國HCC的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。因其起病隱匿,進(jìn)展期快,惡性度高,預(yù)后極差,給人民健康和社會經(jīng)濟(jì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。近些年隨著對HCC治療理念的不斷認(rèn)知,HCC規(guī)范化診治的不斷推廣,以手術(shù)為主的綜合治療策略很大程度地減少了術(shù)后復(fù)發(fā)率、提高了患者生存率,但5年總體生存期仍不理想。如何更加有效地防治HCC成為進(jìn)一步提高患者生存率的瓶頸問題。蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者,以蛋白質(zhì)表達(dá)水平,翻譯后修飾,蛋白與蛋白相互作用為研究對象的蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸成為生命科學(xué)研究中的熱點領(lǐng)域。其在腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制研究、診斷／預(yù)后分子標(biāo)記物篩選、藥物作用靶點與作用機制研究、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和蛋白分子功能研究等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。 目的： 本研究旨在利用蛋白質(zhì)組學(xué)篩選HCC組織與配對癌旁組織間差異表達(dá)的蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)與HCC發(fā)生發(fā)展可能密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白。再通過大樣本重點驗證差異表達(dá)蛋白氨基酰化酶1(aminoacylase-1, ACY1)在HCC組織及配對癌旁組織、HCC患者血清與健康人血清中的表達(dá)水平,統(tǒng)計分析ACY1蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。并在HCC細(xì)胞株中干擾或過表達(dá)ACY1,進(jìn)一步明確ACY1在HCC細(xì)胞株中的生物學(xué)功能,最后利用基因芯片初步探究ACY1參與HCC發(fā)生發(fā)展的可能分子機制。 方法： 1.利用雙向熒光差異凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)篩選HCC組織及其配對癌旁組織間差異表達(dá)蛋白,并質(zhì)譜鑒定。 2.收集128例HCC患者腫瘤組織及配對癌旁組織,利用實時熒光定量PCR、 Western免疫印跡、免疫組化等方法驗證差異表達(dá)蛋白ACY1在HCC腫瘤組織及配對癌旁組織中的表達(dá)情況。根據(jù)ACY1在HCC組織中的蛋白表達(dá)水平,分析ACY1與HCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。 3.收集21例健康人血清及40例HCC患者血清,利用酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)技術(shù)檢測ACY1血清表達(dá)水平。 4.通過體外轉(zhuǎn)染HCC細(xì)胞株SMMC7721(ACY1-siRNA)和BEL74O2(ACY1腺病毒)的方式,分別干擾或過表達(dá)ACY1,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式細(xì)胞凋亡實驗、流式細(xì)胞周期實驗、細(xì)胞侵襲實驗檢測ACY1對HCC細(xì)胞增殖、凋亡、周期和侵襲能力的影響。在BEL7402細(xì)胞中過表達(dá)ACY1,通過裸鼠體內(nèi)成瘤實驗觀察其對HCC細(xì)胞成瘤能力的影響。 5.在HCC細(xì)胞株SMMC7721中干擾ACY1表達(dá),利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選,進(jìn)一步探究ACY1參與HCC發(fā)生發(fā)展的可能分子機制。 結(jié)果： 1.本實驗中2D-DIGE分析得到HCC組織及配對癌旁組織間差異表達(dá)蛋白30個(倍數(shù)改變≥1.5倍,p0.05),質(zhì)譜鑒定得到ACY1、keratin8等差異蛋白11個(倍數(shù)改變≥2.5倍,p0.05)。 2.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示ACY1mRNA在HCC組織中表達(dá)水平明顯低于配對癌旁組織(p0.05)。Western免疫印跡結(jié)果表明ACY1蛋白在HCC組織中表達(dá)水平同樣明顯低于配對癌旁組織。免疫組化結(jié)果分析提示ACY1組織蛋白表達(dá)水平與HCC患者血清甲胎蛋白(AFP)水平(p=0.033)及血管侵犯(p=0.027)密切相關(guān),與患者性別、年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級無關(guān)。 3.血清ACY1表達(dá)水平在HCC患者中高于健康人(p0.05),提示ACY1是HCC診斷的潛在分子標(biāo)記物。 4.體外細(xì)胞功能學(xué)實驗表明干擾ACY1表達(dá)后,SMMC7721細(xì)胞的增殖能力與侵襲能力增強。過表達(dá)ACY1后,BEL7402細(xì)胞的增殖能力與侵襲能力減弱。裸鼠成瘤實驗表明,過表達(dá)ACY1的BEL7402細(xì)胞株成瘤能力明顯減弱。 5.基因芯片結(jié)果顯示ACY1沉默表達(dá)引起1726個差異基因改變(倍數(shù)改變≥1.5倍,p0.05),差異基因主要分布在TGFP和MAPK等信號通路。干擾ACY1表達(dá)后,ERKl和TGFβ1蛋白表達(dá)水平升高。 結(jié)論： 1.相對于癌旁組織,HCC組織中ACY1蛋白表達(dá)水平下調(diào),提示ACY1可能與HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān)。 2.HCC患者血清ACY1表達(dá)水平高于健康人,提示ACY1具有作為HCC患者診斷分子標(biāo)記物的潛在價值。 3.沉默ACY1表達(dá)可增強SMMC7721細(xì)胞的增殖及侵襲能力,過表達(dá)ACY1可抑制BEL7402細(xì)胞的增殖及侵襲能力。 4.ERK1和TGFβ1是ACY1參與HCC發(fā)生發(fā)展的重要靶分子。
[Abstract]:Background:
Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common malignant tumor of the digestive system
New cases of HCC in our country and the number of deaths were ranked first in the world. Because of its insidious onset, progress fast, high malignancy and poor prognosis, to bring a heavy burden on people's health and social economy. In recent years with the continuous treatment of HCC cognitive concept, HCC standardized diagnosis and treatment of continuous promotion, comprehensive treatment strategies in operation the greatly reduced the postoperative recurrence rate and improve the survival rate of the patients, but 5 years overall survival is still not ideal. How to effectively prevent HCC problems become a bottleneck in improving the survival rate of patients. The protein is a vital function of the performer, the expression level of the protein, posttranslational modification, protein and protein the interaction of learning has become a hot topic in life science research for the proteome research object. The research development of molecular mechanism in cancer screening, diagnosis and prognosis of molecular markers and drug targets The research of point and action mechanism, cell signaling and protein molecular function are playing a more and more important role.
Objective:
The purpose of this study is to use proteomics screening of differentially expressed HCC tissue and paired adjacent tissue protein, found that the occurrence and development of key protein associated with HCC. Through large sample focus on the verification of differentially expressed proteins of aminoacylase 1 (aminoacylase-1, ACY1) in HCC tissues and paired adjacent, the expression level of serum patients with HCC in healthy human serum, the relationship between the statistical analysis of the expression level of ACY1 protein and HCC in patients with clinical pathologic parameters. And the interference in HCC cells or ACY1 expression, to further clarify the biological function of ACY1 in HCC cell line, finally using gene chip ACY1 to participate in the preliminary inquiry the possible molecular mechanism of the occurrence and development of HCC.
Method錛，

本文編號：1494074