本文關(guān)鍵詞： miRNA-141 結(jié)直腸癌 生物學(xué)功能 生物信息學(xué) 靶基因　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在我國,結(jié)直腸癌是非常常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤,近20年來尤其在大城市,發(fā)病率明顯上升,據(jù)《2015年中國腫瘤登記年報》發(fā)布數(shù)據(jù),結(jié)直腸癌的發(fā)病率已超過肝癌,僅次于肺癌和胃癌,在惡性腫瘤中排列第三;在惡性腫瘤的死亡率排列第五,次于肺癌、肝癌、胃癌和食管癌。在國內(nèi),結(jié)直腸癌的早期診斷率仍然很低,約60%的患者為中晚期。除此之外,結(jié)直腸癌呈現(xiàn)出患病人數(shù)多及較低的5年生存率等特征。上述,也是結(jié)直腸癌成為癌癥患者主要死因的根源。手術(shù),可以說是結(jié)直腸癌有望治愈的唯一方式。然而,很多患者即便接受過結(jié)直腸癌根治術(shù),還是可能再次復(fù)發(fā)甚至是轉(zhuǎn)移。術(shù)后,采取輔助放化療方案來對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行治療,或可減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險。對晚期結(jié)直腸癌患者來說,化療在綜合性治療中同樣起著極為關(guān)鍵的作用。但是,結(jié)直腸癌患者在化療期間,始終會有無法回避的問題——耐藥。由此可見:越早對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行規(guī)范化診治,其5年生存率越能得以提高。因此,探索敏感性較強(qiáng)的分子標(biāo)志物,找到分子靶標(biāo)和做好預(yù)后評估,這是十分重要的。mi RNA屬于重要的非編碼小分子RNA,在機(jī)體中呈現(xiàn)內(nèi)源性表達(dá),其長度約為18-25個核苷酸。人類基因中,mi RNA分子的占比僅僅為1%,卻對1/3甚至更多的基因表達(dá)、修飾、翻譯以及轉(zhuǎn)錄等發(fā)展過程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。mi RNA,或可作為價值突出的分子標(biāo)志物,為臨床及早診治惡性腫瘤、做好預(yù)后評估提供全新的方向。mi RNA-200家族,已是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。mi RNA-200家族有5個關(guān)鍵的成員:1)mi RNA-200a;2)mi RNA-200b;3)mi RNA-200c;4)mi RNA-141;5)mi RNA-429。該家族呈現(xiàn)出高保守性、較強(qiáng)的時序性、基因簇集性以及組織特異性等諸多特點(diǎn)。在肝癌以及腎細(xì)胞癌等多種惡性腫瘤中,該家族均有表達(dá)水平下調(diào);然而,在膀胱癌、宮頸癌等惡性腫瘤中,則表達(dá)水平上調(diào)。已有研究證實(shí),mi RNA-200家族中的5個成員間可協(xié)同作用也可單獨(dú)作用,協(xié)同作用時能對ZEB1及ZEB2的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié),單獨(dú)作用時,其5個成員還能發(fā)揮阻止EMT發(fā)生的作用。然而,在人類常見的惡性腫瘤中,該家族所擔(dān)任的角色卻尚未得到明確的研究結(jié)論。本研究通過實(shí)時定量PCR技術(shù)來對mi RNA-200家族中的熱門基因mi RNA-141在結(jié)直腸癌以及癌旁正常兩種組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,同時研究其表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)。利用定量Real-time PCR檢測mi RNA-141在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞中的表達(dá)含量,通過瞬時轉(zhuǎn)染法將mi RNA-141mimics或者是陰性對照分別轉(zhuǎn)入到人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29中,構(gòu)建高表達(dá)mi RNA-141的模型;接著,利用MTT法來對腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)進(jìn)行檢測,借助流式細(xì)胞儀對人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29的周期變化進(jìn)行分析,最后,通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來觀察人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29自身的遷移能力,分析mi RNA-141對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,從而為進(jìn)一步闡明mi RNA-141在結(jié)直腸癌發(fā)生、演變中擔(dān)任的角色提供理論依據(jù)。借助生物信息學(xué)軟件初步預(yù)測mi RNA-141潛在可能的靶基因,之后進(jìn)行潛在靶基因的篩選。最后在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29中,利用雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)來對靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,以期探討該基因作為腫瘤標(biāo)記物及抗腫瘤治療靶點(diǎn)的可行性研究,希望能夠?yàn)榕R床上的難題提供一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),為以后深入研究mi RNA-141的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。第一部分 micro RNA-141在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性目的:探討mi RNA-141在結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織中不同的表達(dá)水平,探討其表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)之間存在的關(guān)聯(lián)。方法:收集結(jié)直腸癌患者58例術(shù)后的切除標(biāo)本,通過定量Real-time PCR法來對結(jié)直腸癌以及癌旁正常兩種組織中mi RNA-141的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,通過t檢驗(yàn)以及秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,探討mi RNA-141的表達(dá)水平同結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)存在的關(guān)聯(lián)。結(jié)果:1結(jié)直腸癌組織以及癌旁正常組織中mi RNA-141的表達(dá)水平。通過定量Real-time PCR法來測定mi RNA-141在58例結(jié)直腸癌組織及與其配對的癌旁正常組織中的相對表達(dá)情況。結(jié)果顯示58例結(jié)直腸癌病例癌組織中mi RNA-141的表達(dá)含量相較于癌旁正常組織明顯下調(diào),結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(Z值-6.314,P0.001),其中,mi RNA-141在84.48%(49/58)的癌組織中的表達(dá)相較于癌旁正常組織明顯下調(diào)。2 mi RNA-141的表達(dá)水平和結(jié)直腸癌患者病理參數(shù)之間的關(guān)系。通過秩和檢驗(yàn),分析mi RNA-141的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者各項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示:在58例結(jié)直腸癌癌組織中,mi RNA-141的檢測水平和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移以及腫瘤浸潤深度之間有明顯的相關(guān)性(P0.05),而與患者的性別、年齡、組織學(xué)分級、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及脈管瘤栓等因素,則未見明顯的相關(guān)性(P0.05)。第二部分micro RNA-141對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究目的:研究mi RNA-141對人結(jié)直腸癌胞株HT29細(xì)胞的增殖、周期以及遷移能力的影響。方法:運(yùn)用定量Real-time PCR法來對3株結(jié)直腸癌細(xì)胞中各自的表達(dá)水平分別進(jìn)行檢測,選定體外細(xì)胞模型,轉(zhuǎn)染mi RNA-141 mimics或者是陰性對照,構(gòu)建高表達(dá)mi RNA-141的模型;之后,利用MTT法來對腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)進(jìn)行檢測,借助流式細(xì)胞儀及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞周期及遷移能力,探討結(jié)直腸癌細(xì)胞中mi RNA-141水平對細(xì)胞各種生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究。結(jié)果:1 mi RNA-141在多株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平。通過定量Real-time PCR分別對3株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(HCT8、HT29和HCT116)的mi RNA-141表達(dá)水平進(jìn)行檢測,并取癌旁正常組織檢測值作為對照,由此表明:mi RNA-141在HCT8、HT29和HCT116這3株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著下調(diào),降低的倍數(shù)依次為9.92倍、7.28倍以及2.95倍(P0.05)。2人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29轉(zhuǎn)染后mi RNA-141的表達(dá)水平。應(yīng)用定量Real-time PCR法對成功轉(zhuǎn)染了mi RNA-141 mimics以及陰性對照組的細(xì)胞中mi RNA-141的不同表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染mi RNA-141mimics 48h后結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞中mi RNA-141的表達(dá)水平相較于空白、陰性兩個對照組均有明顯的上調(diào),平均上調(diào)倍數(shù)為10.5倍(P0.05)。這就說明:mi RNA-141 mimics已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)染。3 mi RNA-141過表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞增殖產(chǎn)生的影響。轉(zhuǎn)染mi RNA-141以及陰性對照24h、48h以及72h三個時間點(diǎn),通過MTT方法對HT29細(xì)胞實(shí)際的增殖狀態(tài)分別作出檢測,結(jié)果:轉(zhuǎn)染24h、48h以及72h后,mi RNA-141 mimics實(shí)驗(yàn)組在各個時間點(diǎn)的OD值依次為0.307±0.010、0.361±0.015以及0.461±0.028;陰性對照組相應(yīng)的OD值則分別為0.338±0.006、0.503±0.008以及0.774±0.011,不同時間點(diǎn)上,兩組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。利用OD值可以對細(xì)胞抑制率進(jìn)行計算,mi RNA-141 mimics實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染24h時的抑制率為10.70±1.87%,轉(zhuǎn)染48h時的抑制率為30.34±1.25%,而在轉(zhuǎn)染72h時的抑制率則為40.89±3.16%;陰性對照組,在不同時間點(diǎn)上的抑制率依次為1.59±1.18%、2.92±1.55%和0.86±0.37%,兩組相比有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)�？梢�:結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mi RNA-141水平升高,能對結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖起到較好的抑制作用。4 mi RNA-141過表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞周期產(chǎn)生的影響。借助流式細(xì)胞儀來對mi RNA-141轉(zhuǎn)染48h之后的HT29細(xì)胞周期作出檢測,由此得知:轉(zhuǎn)染48h后,mi RNA-141 mimics實(shí)驗(yàn)組在G1期、S期以及G2期這三個不同分期上的占比依次為73.77±0.84%、8.97±0.44%和18.46±1.39%,而陰性對照組三期的比例分別為42.11±0.81%、43.56±1.26%以及14.73±2.05%,其中,G1期、S期上兩組相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),G1期伴有明顯的阻滯現(xiàn)象。這就提示:結(jié)直腸癌細(xì)胞中的mi RNA-141水平升高,或可對細(xì)胞由G1期發(fā)展為S期起到較好的阻滯和延緩作用。5 mi RNA-141過表達(dá)對人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29細(xì)胞遷移能力產(chǎn)生的影響。利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行檢驗(yàn)和分析,由此得知:轉(zhuǎn)染24h后,mi RNA-141 mimics實(shí)驗(yàn)組在顯微鏡下觀察到的遷移寬度為345.40±17.34μm,陰性對照組則為270.61±18.31μm,相比有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。提示:mi RNA-141過表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞,其遷移能力相較于陰性對照組明顯更低。第三部分micro RNA-141靶基因的驗(yàn)證及其機(jī)制研究目的:篩選和檢驗(yàn)MAP4K4 m RNA可否作為mi RNA-141的靶基因,為探討mi RNA-141有效的分子機(jī)制提供可靠的依據(jù)。方法:借助生物信息學(xué)軟件來預(yù)測分析mi RNA-141的靶序列并進(jìn)一步初篩靶基因;確定靶基因研究對象后,通過雙螢光素酶報告基因法,進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測靶基因是否真實(shí)可靠。結(jié)果:1運(yùn)用Micro RNA生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件預(yù)測mi RNA-141靶基因。應(yīng)用Target Scan、Pic Tar和mi Randa等諸多類型的生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件進(jìn)行初篩;具體結(jié)果:mi RNA-141位于人12號染色體,具體位置為12:6964097-6964191[+]。應(yīng)用Target Scan、Pic Tar和mi Randa軟件預(yù)測分析的mi RNA-141可能的靶基因數(shù)依次為1016、465和7721。本實(shí)驗(yàn)選取了近年來備受關(guān)注的MAP4K4基因(NM_004834)進(jìn)行重點(diǎn)研究,得知3’UTR中可能存在和mi RNA-141之間進(jìn)行結(jié)合的1段位點(diǎn)。結(jié)合該序列建立起報告載體,之后通過雙螢光素酶報告基因法來對其作出進(jìn)一步分析和驗(yàn)證。2經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):MAP4K4可作為mi RNA-141的靶基因。我們利用“雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)”對MAP4K4究竟可否作為mi RNA-141的靶基因作出了有效驗(yàn)證。研究首先建立了MAP4K4 3’UTR以及突變型MAP4K43’UTR各自的表達(dá)載體;利用人結(jié)直腸細(xì)胞系HT29細(xì)胞作為模型,依次向人結(jié)直腸細(xì)胞系HT29細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染(1)MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141mimics;(2)MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141 NC;(3)MAP4K4 mut 3’UTR+mi RNA-141 mimics;(4)MAP4K4 mut 3’UTR+mi RNA-141 NC;劃分為4個不同的實(shí)驗(yàn)小組;48h后可知:螢光素蛋白的表達(dá)水平有所下調(diào)的僅為MAP4K4 3’UTR+mi RNA-141 mimics組(P0.05),說明mi RNA-141對MAP4K4 3’UTR報告基因的活性存在靶向抑制。然而,mi RNA-141卻無法對MAP4K4 mut 3’UTR表達(dá)載體起到任何的抑制作用;mi RNA-141 NC同樣也無法對MAP4K4 3’UTR表達(dá)載體和MAP4K4mut 3’UTR表達(dá)載體起到任何的抑制作用(P0.05)。本研究表明MAP4K4是mi RNA-141的靶基因,提示mi RNA-141對MAP4K4有顯著的抑制功能。結(jié)論:1 mi RNA-141在結(jié)直腸癌患者癌組織中表達(dá)顯著低于配對癌旁非癌組織,提示mi RNA-141可能不適合作為結(jié)直腸癌早期診斷的分子標(biāo)志物,然而,上調(diào)mi RNA-141內(nèi)源性表達(dá)水平,可能有助于臨床防治結(jié)直腸癌,有望變成將來對結(jié)直腸癌進(jìn)行診治的分子靶標(biāo)。2 mi RNA-141在癌組織中的低表達(dá)與腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有明顯的相關(guān),推測其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、演變中發(fā)揮重要的作用。3 mi RNA-141在3株人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT8、HT29和HCT116中的表達(dá)水平均有明顯的下調(diào),和結(jié)直腸癌組織檢測情況相符。4 mi RNA-141在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29的過表達(dá)可對細(xì)胞增殖起到較好的抑制作用。說明mi RNA-141或可成為細(xì)胞增殖的重要的調(diào)控分子,從而作為臨床對結(jié)直腸癌進(jìn)行治療的有效靶標(biāo)。5 mi RNA-141在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29的過表達(dá)可阻滯腫瘤細(xì)胞由G1期發(fā)展為S期;故此推測:mi RNA-141或可對細(xì)胞周期存在影響,從而對細(xì)胞增殖發(fā)揮相應(yīng)的抑制作用。6 mi RNA-141在人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29的過表達(dá)可削弱細(xì)胞在體外所擁有的遷移能力。故此推測:mi RNA-141或可對細(xì)胞遷移存在影響,從而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。7利用“雙螢光素酶報告基因系統(tǒng)”驗(yàn)證了MAP4K4確可作為mi RNA-141有效的靶基因,說明mi RNA-141對MAP4K4存在抑制性功能的作用;mi RNA-141可能通過對MAP4K4的生物學(xué)功能加以抑制,從而對結(jié)直腸癌的發(fā)生、演變以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等起到調(diào)節(jié)的作用,為臨床繼續(xù)探討和明確mi RNA-141在結(jié)直腸癌中的分子機(jī)制提供有力的參考。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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1 鄭志范;蘇華芳;鄒燕;彭振;吳式t;;microRNA在食管癌放射抵抗細(xì)胞表達(dá)譜研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2011年09期

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本文編號：1484954