本文關(guān)鍵詞： miR-17-5p inhibitor SRCIN1 骨肉瘤 增殖 侵襲　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:骨肉瘤(osteosarcoma)是一種由間葉細(xì)胞發(fā)展而來(lái)的高度惡性腫瘤,是我國(guó)青少年最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,占原發(fā)性骨腫瘤的17%。這種惡性腫瘤以能產(chǎn)生在組織學(xué)上分化完全的或分化不完全的類骨質(zhì)樣組織為特征。骨肉瘤往往呈局部浸潤(rùn)性、侵襲性生長(zhǎng),早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移。一般認(rèn)為,骨肉瘤分為普通型,毛細(xì)血管擴(kuò)張型,骨膜外型,骨膜型,低級(jí)中心型,小細(xì)胞型,其他非典型類型等等。各個(gè)類型都有其各自組織形態(tài)學(xué)上的特點(diǎn)。近年來(lái),隨著現(xiàn)代化的,個(gè)體化的大劑量化學(xué)藥物聯(lián)合外科手術(shù)療法,使得原位性,非轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的5年存活率達(dá)到了60-70%。然而,對(duì)于轉(zhuǎn)移性骨肉瘤和復(fù)發(fā)性骨肉瘤的診療,結(jié)果仍然差強(qiáng)人意。病因不明確,腫瘤自身復(fù)雜的基因突變性、廣泛的組織差異性、缺乏特定的生物標(biāo)記性、高侵襲性等一系列問(wèn)題使得人類對(duì)于骨肉瘤的生物學(xué)特性的認(rèn)知仍然面臨著各種挑戰(zhàn)。目前,人們對(duì)骨肉瘤的研究與探索主要集中在發(fā)病的分子機(jī)制,尤其是疾病發(fā)展過(guò)程中各種有代表性的分子標(biāo)記物和治療基因靶點(diǎn)等方面。所以,從基因水平上探索骨肉瘤疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律和病理機(jī)制;探尋新的特異性強(qiáng),靈敏度高的分子標(biāo)記位點(diǎn)對(duì)于診斷和防治顯得尤為重要。Micro RNAs(mi RNAs)是一類長(zhǎng)度在18-25bp,單鏈、非編碼小RNA,可通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平,與對(duì)應(yīng)的m RNA的3’UTR結(jié)合,調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程,通過(guò)從分子層面來(lái)影響多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)介導(dǎo)腫瘤疾病的發(fā)生,發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。最新有報(bào)道表明,mi R-17-5p在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),如肺癌、乳腺癌、膀胱癌、直腸癌、胃癌、肝癌和骨肉瘤。然而,關(guān)于mi R-17-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的各項(xiàng)生理功能的影響及其分子生物學(xué)的發(fā)生機(jī)制尚未見(jiàn)有所報(bào)道。因此,我們?nèi)斯ず铣闪薽i R-17-5p的抑制物(mi R-17-5p inhibitor),探討mi R-17-5p inhibitor對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的遷移,侵襲,增殖、凋亡等各項(xiàng)細(xì)胞生理功能的影響,揭示其發(fā)生,發(fā)展的作用機(jī)制和原理,為骨肉瘤疾病的臨床診療提供分子生物學(xué)的理論基礎(chǔ),為此種腫瘤疾病供新的認(rèn)知角度。研究目的本次實(shí)驗(yàn)研究收集骨肉瘤患者手術(shù)中的骨肉瘤組織和緊鄰骨肉瘤的腫瘤旁邊的病理組織為標(biāo)本,探究骨肉瘤組織及其骨肉瘤旁邊組織中mi R-17-5p和SRCIN1基因表達(dá)水平的差異。人工培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞株MG63,觀察轉(zhuǎn)染mi R-17-5p inhibitor基因后對(duì)骨肉瘤遷移、侵襲、增殖、凋亡等各項(xiàng)細(xì)胞生理功能的影響;探索mi R-17-5p的靶標(biāo)蛋白及其分子層面的調(diào)控機(jī)制,探尋新的mi RNA,為新的mi RNA在骨肉瘤的防治作用提供基礎(chǔ)研究支持及新靶點(diǎn)的探討。方法1.收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院(2015年1月至2016年9月期間)不同骨肉瘤患者骨肉瘤組織及對(duì)應(yīng)骨肉瘤旁邊組織標(biāo)本共計(jì)28例,于-80℃冰箱中存放備用。利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)技術(shù)手段檢測(cè)這28例骨肉瘤病理組織,骨肉瘤旁邊的病理組織中mi R-17-5p及SRCIN1基因的m RNA的表達(dá)水平的差異,對(duì)比出二者之間的差異,分析二者間有無(wú)相關(guān)性。使用免疫印跡法(Western blot)實(shí)驗(yàn)方法,檢測(cè)SRCIN1蛋白在骨肉瘤組織和骨肉瘤腫瘤旁邊病理組織中的蛋白水平的表達(dá)情況。2.采用RT-q PCR檢測(cè)技術(shù)分別檢測(cè)人成骨細(xì)胞株h FOB1.19和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63中mi R-17-5p的SRCIN1蛋白基因的m RNA表達(dá)情況。3.人工合成mi R-17-5p inhibitor agomir和mi R-17-5p inhibitor negative control,并通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞株MG63中。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)mi R-17-5p inhibitor組:轉(zhuǎn)染mi R-17-5p inhibitor agomir。(2)NC組:轉(zhuǎn)染mi R-17-5p inhibitor negative control。(3)Blank組:只轉(zhuǎn)染進(jìn)去脂質(zhì)體試劑。4.采用CCK-8實(shí)驗(yàn)方法,法檢測(cè)三組MG63細(xì)胞增殖情況,觀測(cè)三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的增殖情況是否存在差異性。5.采用流式細(xì)胞術(shù)和Tunel實(shí)驗(yàn)技術(shù),對(duì)比觀測(cè)三組骨肉瘤細(xì)胞MG63的凋亡是否存在差異性。6.利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),觀測(cè)三組骨肉瘤細(xì)胞MG63的遷移能力是否存在差異性。7.通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)方法,觀測(cè)三組骨肉瘤細(xì)胞MG63的侵襲能力是否產(chǎn)生李差異性。8.運(yùn)用Target Scan軟件和mi Randa信息庫(kù)的生物信息學(xué)軟件對(duì)mi R-17-5p的作用靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果構(gòu)建出含有SRCIN1的3’UTR區(qū)的野生型和突變型的人工重組雙熒光素酶基因?qū)W載體,分成兩組,分別將其與mi R-17-5p agomir和mi R-17-5p negative control一起轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤細(xì)胞株MG63中,并利用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告技術(shù)原理,證實(shí)SRCIN1蛋白正是mi R-17-5p的作用靶標(biāo)目的蛋白。9.采用Western blot實(shí)驗(yàn)原理,檢測(cè)三組細(xì)胞中SRCIN1的表達(dá)情況。結(jié)果1.與骨肉瘤瘤旁邊組織相比,在骨肉瘤病理組織中,mi R-17-5p的相對(duì)含量升高明顯(P0.01);SRCIN1的m RNA相對(duì)含量下降明顯(P0.01)。骨肉瘤病理組織中SRCIN1的蛋白表達(dá)水平較骨肉瘤旁邊的病理組織明顯降低。2.在人骨肉瘤細(xì)胞株MG63中,mi R-17-5p的表達(dá)明顯高于成骨細(xì)胞h FOB1.19(P0.01),SRCIN1的m RNA表達(dá)明顯低于成骨細(xì)胞h FOB1.19(P0.01)。3.轉(zhuǎn)染mi R-17-5P inhibitor agomir后,mi R-17-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組的mi R-17-5p表達(dá)水平顯著低于NC組和Blank組,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)果表明骨肉瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)染mi R-17-5p inhibitor后,mi R-17-5p的表達(dá)水平明顯降低。4.在CCK-8(Cell Counting Kit)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中,與NC組和Blank組相比較,轉(zhuǎn)染mi R-17-5P inhibitor實(shí)驗(yàn)組中,骨肉瘤細(xì)胞在OD450處的吸光光度值明顯下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而NC組和Blank組間相比較后發(fā)現(xiàn),兩組骨肉瘤細(xì)胞的吸光光度數(shù)值間的差異不大,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.流式細(xì)胞技術(shù)和Tunel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,與NC組和Blank組比較,轉(zhuǎn)染mi R-17-5p inhibitor實(shí)驗(yàn)組的骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率明顯高于NC組和Blank組,其間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而NC組和Blank組間骨肉瘤細(xì)胞的凋亡率差別不大,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,與NC組和Blank組相比較,轉(zhuǎn)染mi R-17-5P inhibitor實(shí)驗(yàn)組,其穿過(guò)基底膜的骨肉瘤細(xì)胞數(shù)明顯相對(duì)較少,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。NC組和Blank組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)大致相當(dāng),期間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與NC組和Blank組比較,轉(zhuǎn)染mi R-17-5p實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞的遷移能力較NC組和Blank明顯下降;而NC組和Blank組相比較,細(xì)胞的遷移能力相近,無(wú)顯著性差異。8.Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和免疫雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SRCIN1蛋白是mi R-17-5p的作用靶標(biāo)蛋白。9.Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染mi R-17-5p inhibitor agomir的實(shí)驗(yàn)組與NC組和Blank組比較,SRCIN1的蛋白表達(dá)水平較明顯升高,而NC組與Blank組比較,兩組細(xì)胞中SRCIN1的蛋白表達(dá)無(wú)差異性。結(jié)論1.在骨肉瘤病理組織和骨肉瘤細(xì)胞中,mi R-17-5p異常高表達(dá),SRCIN1低表達(dá)。2.mi R-17-5p通過(guò)作用于SRCIN1的3’UTR區(qū),負(fù)向調(diào)控其表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)上的作用。3.在骨肉瘤細(xì)胞中,mi R-17-5p的表達(dá)下調(diào)能夠有效抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移、侵襲,增殖能力,并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡,發(fā)揮出對(duì)骨肉瘤的抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R738

【參考文獻(xiàn)】

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