本文關(guān)鍵詞： NSCLC ILT4 腫瘤轉(zhuǎn)移 VEGF-C B7-H3　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景肺癌的發(fā)病率和死亡率是全球惡性腫瘤的第一位,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌患者的80～85%,而且絕大部分初治病人處于進展期或已發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此,如何調(diào)節(jié)和控制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移對于NSCLC的治療至關(guān)重要。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是多因素參與、多步驟完成的生物化學(xué)變化過程,其中腫瘤細胞增殖生存及侵襲遷移能力的增強、逃避免疫打擊以及刺激腫瘤血管淋巴管生成等是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄子(immunoglobulin-like transcript, ILT)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類免疫球蛋白超家族。ILT家族基因都定位于19號染色體相同的區(qū)域,主要在單核細胞、B細胞及樹突狀細胞(dendritic cell, DC)等細胞表達。根據(jù)其功能性質(zhì),ILT家族分為刺激性受體(ILT1, ILT6, ILT7 and ILT8)和抑制性受體(ILT2,ILT3, ILT4 and ILT5),其中抑制性受體胞質(zhì)區(qū)含有免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)長胞質(zhì)尾部,通過募集含SH2結(jié)構(gòu)的酪氨酸磷酸激酶(SH2-containing protein tyrosine phos-phatase,SHP)-1和SHP-2將細胞外信號向細胞內(nèi)傳遞的作用發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),ILT家族成員在一些髓系腫瘤中高表達：ILT2可在T細胞淋巴瘤中高表達,且高表達的ILT2可以拮抗CD3單抗誘發(fā)的細胞死亡；ILT3及ILT4在慢性B淋巴細胞白血病中高表達,且ILT3高表達在伴有淋巴結(jié)浸潤的患者中更常見。我們前期研究發(fā)現(xiàn),ILT4在實體瘤NSCLC、乳腺癌、結(jié)腸癌組織及其相應(yīng)腫瘤細胞株中表達,且ILT4高表達的腫瘤組織中腫瘤浸潤淋巴細胞(tumorinfiltration lymphocytes, TILs)數(shù)量顯著減少,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率明顯增高。近期研究發(fā)現(xiàn),ILT4及其小鼠同源性配對免疫球蛋白樣受體(paired immunoglobulin-like-receptor, PIRB)在急性單核細胞白血病細胞中mRNA的水平明顯升高；在小鼠移植AML模型中,缺失PIRB會導(dǎo)致白血病細胞分化；在胰腺癌細胞中,阻斷ILT4后,細胞運動能力降低；揭示ILT4在促進腫瘤進展中發(fā)揮著重要的作用；然而ILT4在NSCLC發(fā)生進展中的作用及分子機制目前尚不清楚。研究目的為明確ILT4在NSCLC疾病進展中的作用,我們通過轉(zhuǎn)染技術(shù),過表達或干擾NSCLC細胞中的ILT4,檢測ILT4對NSCLC細胞增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)表型的影響；進行表達譜基因芯片分析,進一步明確ILT4促進腫瘤進展的分子機制,為ILT4在NSCLC的治療中的潛在價值提供理論基礎(chǔ)。研究方法1.通過PCR及Western blot檢測ILT4基因在NSCLC細胞株中的表達,篩選出高表達ILT4的細胞株和低表達ILT4的細胞株。選擇ILT4表達低的細胞株H1650和H1975轉(zhuǎn)染ILT4質(zhì)粒上調(diào)ILT4表達,并通過慢病毒感染建立穩(wěn)定過表達ILT4細胞株；選擇ILT4高表達的細胞株A549和H226轉(zhuǎn)染ILT4shRNA干擾ILT4表達,并通過慢病毒感染建立穩(wěn)定干擾ILT4細胞株。2.通過生長曲線及平板克隆實驗,檢測ILT4對NSCLC細胞生長、增值的影響；通過Annexin V-FITC/PI流式細胞術(shù),檢測ILT4對NSCLC細胞凋亡的影響；通過Transwell小室侵襲遷移實驗,檢測ILT4對NSCLC細胞侵襲遷移能力的影響。3.通過慢病毒感染建立穩(wěn)定過表達ILT4的NSCLC細胞株ILT4/H1650及對照細胞株NC/H1650;穩(wěn)定干擾ILT4的NSCLC細胞株shILT4/A549及對照細胞株shNC/A549,選擇BALB/c Nude裸鼠分別皮下注射上述細胞。觀察ILT4對NSCLC細胞體內(nèi)成瘤能力的影響。4.通過慢病毒感染建立穩(wěn)定過表達ILT4的NSCLC細胞株ILT4/H1650及對照細胞株NC/H1650;穩(wěn)定干擾ILT4的NSCLC細胞株shILT4/A549及對照細胞株shNC/A549,選擇BALB/c Nude裸鼠尾靜脈注射細胞。觀察ILT4對腫瘤細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。5.通過Western blot檢測ILT4對基因MAPK通路相關(guān)靶蛋白ERK、p38MAPK及JNK的表達的影響,并篩選ILT4下游信號通路ERK信號通路；通過加入信號通路抑制劑阻斷信號通路,觀察ILT4過表達細胞株在抑制ERK信號通路后,對NSCLC細胞增殖及侵襲遷移的影響。6.通過表達譜基因芯片前期篩選,并進行PCR及Western blot驗證,篩選檢測ILT4對基因VEGF-C的表達的影響；并通過加入ERK信號通路抑制劑觀察ILT4是否通過此信號通路調(diào)節(jié)VEGF-C的表達；通過加入siRNA阻斷VEGF-C表達,觀察ILT4過表達細胞株抑制VEGF-C表達后,對NSCLC細胞增殖及侵襲遷移的影響；7.利用免疫組織化學(xué)染色檢測ILT4和VEGF-C在腫瘤組織及相應(yīng)癌旁正常組織中的表達；根據(jù)免疫組化染色評分結(jié)果,統(tǒng)計分析ILT4和VEGF-C表達水平與NSCLC患者臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性；收集NSCLC患者的隨訪資料,采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,應(yīng)用log-rank檢驗分析ILT4和VEGF-C的表達與NSCLC患者生存時間之間的關(guān)系。8.通過表達譜基因芯片前期篩選,并通過PCR及Western blot驗證,檢測ILT4對共刺激分子B7-H3的表達及PI3K/AKT/mTOR信號通路激活的影響：通過加入P13K及mTOR信號通路抑制劑,觀察ILT4是否通過此信號通路調(diào)節(jié)B7-H3的表達；9.利用免疫組織化學(xué)染色檢測ILT4和B7-H3在NSCLC組織中的表達及其相關(guān)性,并分析ILT4及B7-H3表達水平與腫瘤TIL數(shù)量間的關(guān)系。研究結(jié)果1.ILT4促進NSCLC細胞增殖及侵襲遷移PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示：ILT4在本實驗中所用5株NSCLC細胞株(A549、H226、H1299、H1650及H1975)中均有表達,其中H1650及H1975表達最低,A549及H226表達最高。過表達ILT4表達后,H1650及H1975細胞增殖及侵襲遷移能力明顯增強；干擾ILT4表達后,A549及H226細胞增殖及侵襲遷移能力明顯受到抑制；然而,ILT4對NSCLC細胞的抗凋亡能力無明顯影響。2.ILT4促進NSCLC細胞體內(nèi)成瘤及轉(zhuǎn)移通過建立皮下移植模型發(fā)現(xiàn)ILT4對NSCLC細胞體內(nèi)成瘤及瘤體生長均有顯著的影響：過表達ILT4后,腫瘤生長速度顯著快于其對照組,腫瘤組織重量大于其對照組；同樣,干擾表達ILT4后,腫瘤生長速度顯著慢于其對照組,腫瘤組織重量小于其對照組。通過建立尾靜脈注射模型發(fā)現(xiàn)ILT4對NSCLC細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移亦有明顯的影響：造模后6周取小鼠肺組織,計數(shù)表面腫瘤表面轉(zhuǎn)移灶,并通過HE染色進行病理形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示過表達ILT4后,裸鼠肺組織轉(zhuǎn)移灶數(shù)目顯著多于其對照組；干擾ILT4后,裸鼠肺組織轉(zhuǎn)移灶數(shù)目小于其對照組。3.ILT4通過激活下游ERK信號通路促進NSCLC細胞惡性表型Western blot檢測結(jié)果顯示：過表達ILT4后,H1650及H1975細胞中ERK的磷酸化水平明顯升高；而干擾ILT4后,A549及H226細胞中ERK的磷酸化水平明顯降低；而無論過表達或干擾ILT4,對p38MAPK及JNK通路均無顯著影響。此外,過表達ILT4的細胞株ILT4/H1650及ILT4/H1975,加入ERK信號通路抑制劑U0126后,細胞增殖及侵襲遷移能力明顯受到抑制。4.ILT4通過上調(diào)下游作用分子VEGF-C促進NSCLC細胞惡性表型表達譜基因芯片結(jié)果顯示：ILT4可促進多種生長因子表達上調(diào)。后續(xù)PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示：H1650及H1975細胞過表達ILT4后,細胞中VEGF-C的表達水平明顯升高；而干擾ILT4后,A549及H226細胞中VEGF-C的表達水平明顯降低。在過表達ILT4的細胞株ILT4/H1650及ILT4/H1975中加入ERK信號通路抑制劑U0126后,VEGF-C的表達水平明顯下降。內(nèi)源性高表達ILT4的細胞株A549及H226轉(zhuǎn)染siRNA抑制VEGF-C表達后,細胞增殖侵襲遷移能力明顯受到抑制；在過表達ILT4的細胞株ILT4/H1650及ILT4/H1975中轉(zhuǎn)染siRNA抑制VEGF-C表達后,細胞侵襲遷移能力明顯受到抑制,而細胞增殖能力變化不明顯。5.ILT4在原發(fā)性NSCLC組織腫瘤細胞中的表達與VEGF-C呈正相關(guān)免疫組化檢測結(jié)果顯示：在105例臨床標本中,ILT4陽性表達率45.7%(48/105),并與高齡(p=0.044)、細胞低分化(p=0.038)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.04)及TNM分期(p=0.013)呈正相關(guān)；高表達ILT4的患者5年生存率偏低(p=0.035)；且ILT4與VEGF-C表達呈明顯正相關(guān)p=0.024),ILT4和VEGF-C共表達的患者預(yù)后更差(p=0.009)。6.ILT4上調(diào)免疫共刺激分子B7-H3表達PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示：過表達ILT4后,B7-H3表達水平明顯升高；而干擾ILT4后,細胞B7-H3表達水平明顯降低。此外,過表達ILT4后,AKT、mTOR、ERK的磷酸化水平升高；而干擾ILT4表達后,AKT、mTOR、 ERK的磷酸化水平降低。而且在過表達ILT4的NSCLC細胞株中分別加入P13K及mTOR信號通路抑制劑后,B7-H3表達水平明顯下降；而加入ERK信號通路抑制劑U0126后,B7-H3表達水平無明顯變化。7.ILT4在原發(fā)性NSCLC組織腫瘤細胞中的表達與B7-H3呈正相關(guān)免疫組化檢測結(jié)果顯示：在118例臨床標本中,ILT4與B7-H3表達呈明顯正相關(guān)(p=0.021),并且ILT4和B7-H3共表達的患者腫瘤組織中TILs數(shù)量明顯減少(p=0.007),且預(yù)后較差(p=0.029)。結(jié)論1.體內(nèi)體外實驗證實ILT4可促進NSCLC細胞增殖、侵襲及遷移等多種惡性生物學(xué)行為。2.ILT4可通過激活NSCLC細胞中的ERK信號通路上調(diào)VEGF-C表達,從而影響腫瘤惡性生物學(xué)行為,最終促進腫瘤進展。3.ILT4可通過激活NSCLC細胞中的PI3K/AKT/mTOR信號通路上調(diào)免疫共刺激分子B7-H3的表達,參與腫瘤免疫逃逸,從而促進腫瘤進展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：1482521