發(fā)布時(shí)間：2018-02-01 17:17

  本文關(guān)鍵詞： 食管癌 miR-144-451 基因簇 腫瘤生物標(biāo)志物　出處：《東南大學(xué)》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：miRNA可以與mRNA的3'UTR區(qū)結(jié)合,調(diào)控相應(yīng)編碼蛋白表達(dá),在基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miRNA調(diào)控異常可致機(jī)體細(xì)胞功能異常,研究發(fā)現(xiàn)miRNA異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān), miRNA可能成為腫瘤診斷的重要分子標(biāo)志物。部分miRNA的編碼基因在染色體上位置緊鄰,成簇排列形成miRNA基因簇,研究發(fā)現(xiàn)這些成簇排列的miRNA在表達(dá)和功能上具有較高的相關(guān)性,miRNA基因簇可能作為一個(gè)功能單位,整體調(diào)控生物信號(hào)傳導(dǎo)通路。作為潛在的生物標(biāo)志物,miRNA基因簇能夠更好的反映miRNA對(duì)機(jī)體復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控,因而更加靈敏、可靠。本研究在江蘇省淮安食管癌患者食管癌組織和癌旁組織中分析了miR-144-451基因簇的表達(dá)特征,探討了miR-144-451基因簇異常表達(dá)與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系；并進(jìn)一步在miR-144-451基因簇的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型中初步探討了miR-144-451基因簇在食管癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及調(diào)控機(jī)制。一、miR-144-451基因簇與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的病例對(duì)照研究招募淮安市第一人民醫(yī)院2011～2012年101例病理確診食管癌患者。使用QRT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)食管癌組織和配對(duì)癌旁組織中miR-144-451基因簇單一miRNA(miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732、miR-4732-5p)的表達(dá),與癌旁組織相比,食管癌組織中miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a顯著低表達(dá),其表達(dá)量2-△△CT分別是癌旁組織的37.6%、46.7%、44.3%,miR-4732-5p、miR-4732-3p的表達(dá)在癌組織和癌旁組織中沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用單純病例研究分析環(huán)境因素與miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a表達(dá)改變之間的關(guān)系,結(jié)果顯示miR-144-3p、miR-144-5p的異常表達(dá)與喜食硬食有交互作用,miR-144-5p、miR-451a異常表達(dá)與飲水類(lèi)型有交互作用(P0.05)�；趍iR-144-451基因簇內(nèi)的miRNAs可能存在共表達(dá)的特征,對(duì)各miRNA表達(dá)量經(jīng)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,結(jié)果顯示5種miRNA兩兩之間表達(dá)相關(guān)性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),其中miR-4732-5p與miR-144-5p表達(dá)高度相關(guān)(P0.731)。進(jìn)一步應(yīng)用主成分Logistic回歸分析,識(shí)別了miR-144-451基因簇中的兩個(gè)代表性miRNAs: miR-144-3p和miR-144-5p,兩者的低表達(dá)可增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。二、miR-144-451基因簇對(duì)食管癌細(xì)胞生物行為影響1使用miRNA mimics轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞,分別獲得miR-144-3p、miR-144-5p、 miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型,研究分析基因簇中各miRNA對(duì)細(xì)胞凋亡、周期、遷移、侵襲、和凋亡能力的影響。(1)使用流式細(xì)胞術(shù)(Annexin V-FITC標(biāo)記)檢測(cè)miRNA mimic轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞的凋亡率,miR-144-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞早期凋亡率為(18.70±2.11)%,較對(duì)照組(9.00±1.15)%明顯升高(P0.05)。miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞凋亡率分別為(8.43+3.26)%、(10.00±0.90)%、(9.73±0.64)%、(9.40±0.61)%,與對(duì)照組相比凋亡率差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)使用流式細(xì)胞技術(shù)(PI染色)檢測(cè)miRNA mimic轉(zhuǎn)染48h后細(xì)胞的周期分布。miR-451a過(guò)表達(dá)細(xì)胞中G2期所占比例為(22.84+0.97)%,與對(duì)照組(18.20±1.12)%相比增加了25%。miR-144-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞中(32期所占比例(14.62±1.41)%與對(duì)照組(18.20±1.12)%相比下降了20%。(3)使用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,miR-144-3p、miR-451a、miR-4732-3p可以抑制EC9706細(xì)胞的遷移能力,其對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為15.63±1.00、21.27±1.70、26.97±3.47,較對(duì)照組(36.67±3.58)穿膜細(xì)胞數(shù)均有明顯降低。miR-144-3p、 miR-451a、miR-4732-3p穿膜細(xì)胞中結(jié)晶紫OD值低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)使用Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,miR-144-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞穿膜數(shù)為12.07±1.10,明顯低于對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(25.90±2.26)。miR-144-5p、miR-451a、 miR-4732-3p、miR-4732-5p過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞的侵襲能力無(wú)影響。(5)使用EdU染色成像法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、 miR-4732-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞增殖率分別分別為(34.18±.83)%、(33.56±3.94)%、(34.15±2.94)%、(31.50±2.01)%,與對(duì)照組(41.16±2.13)%相比,四組細(xì)胞增殖率均降低。2構(gòu)建pri-miR-144-451過(guò)表達(dá)載體,使用慢病毒包裝并轉(zhuǎn)染,經(jīng)抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)pri-miR-144-451細(xì)胞。分別檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)pri-miR-144-451 EC9706細(xì)胞的凋亡、周期、遷移、侵襲、增殖能力,以評(píng)價(jià)miR-144-451基因簇整體對(duì)食管癌細(xì)胞影響。結(jié)果顯示miR-144-451基因簇可以導(dǎo)致EC9706細(xì)胞周期阻滯于S和G2期,發(fā)揮抑癌基因作用；miR-144-51基因簇可以明顯抑制EC9706細(xì)胞的侵襲能力,與對(duì)照細(xì)胞相比pri-miR-144-451過(guò)表達(dá)并沒(méi)有引起細(xì)胞凋亡、侵襲、增殖能力的改變。三、miR-144-451基因簇在EC9706中調(diào)控通路分析1使用Targetscan、miRanda、miRDB、PICTAR預(yù)測(cè)miR-144-3p、miR-144-5p、 miR-451a的靶基因,對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因使用DAVID Bioinformatics Resources 6.7進(jìn)行生物學(xué)功能富集分析,結(jié)果顯示miR-144-3p的靶基因最多富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,其次為細(xì)胞形態(tài)功能omiR-144-5p的靶基因最多富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能,其次為轉(zhuǎn)錄功能。miR-451a的靶基因最多富集于增殖調(diào)控功能。2使用Western Blot分別檢測(cè)miRNA mimic(miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、 miR-4732-3p、miR-4732-5p、miR-control)轉(zhuǎn)染細(xì)胞、pri-miR-144-451穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞(pri-miRNA、pri-control)中相應(yīng)蛋白的表達(dá)。蛋白的相對(duì)表達(dá)量A=目的蛋白IOD/內(nèi)參IOD。(1) miRNA mimic轉(zhuǎn)染組和pri-miRNA組β-Catenin總蛋白、非磷酸化β-Catenin蛋白表達(dá)無(wú)改變,miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、miR-4732-3p、miR-4732-5p處理組細(xì)胞中磷酸化β-Cateriin的表達(dá)與miR-control對(duì)照組相比略有增加。與對(duì)照組相比,pri-miRNA組磷酸化β-Catenin表達(dá)增加。(2)與對(duì)照相比miR-144-3p處理組c-Myc總蛋白表達(dá)降低,miR-144-5p處理組c-Myc總蛋白表達(dá)升高；與pri-control組相比pri-miRNA組細(xì)胞中c-Myc總蛋白表達(dá)升高。miR-144-3p組細(xì)胞磷酸化c-Myc蛋白表達(dá)降低,pri-miRNA組磷酸化c-Myc表達(dá)升高。(3)不同處理組間PTEN和ERK1/2表達(dá)無(wú)差異。miR-144-3p、miR-451a、 miR-4732-3p組磷酸化ERKl/2表達(dá)較miR-control組降低；pri-miRNA組磷酸化ERK1/2表達(dá)低于pri-control組。(4) miR-4732-5p處理組p53表達(dá)明顯升高; pri-miRNA組p53蛋白表達(dá)較pri-control組升高。miR-144-3p過(guò)表達(dá)組非活化Caspase3表達(dá)較miR-control組表達(dá)降低。(5)與miR-control組相比, miR-144-3p、miR-4732-5p轉(zhuǎn)染組細(xì)胞MMP9表達(dá)降低；pri-miR-144-451穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中MMP9呈低表達(dá)。(6) miR-144-3p、miR-144-5p過(guò)表達(dá)細(xì)胞磷酸化cdc2表達(dá)較miR-control組表達(dá)降低。pri-miRNA組磷酸化Cdc2表達(dá)則明顯增加。四、主要結(jié)論：(1)miR-144-451基因簇成員miRNA在食管癌和癌旁組織中表達(dá)高度相關(guān),miR-144-451基因簇中miR-144-3p、miR-144-5p低表達(dá)可增加食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),是食管癌的危險(xiǎn)因素。(2)miR-144-451基因簇可以抑制食管癌細(xì)胞的侵襲能力,使食管癌細(xì)胞G2、S期細(xì)胞增加,G1期細(xì)胞減少。其中miR-144-3p可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞早期凋亡；miR-451a可以使細(xì)胞周期阻滯于G2期；miR-144-3p、miR-451a、miR-4732-3p抑制細(xì)胞遷移；miR-144-3p可以抑制食管癌細(xì)胞侵襲能力；miR-144-3p、miR-144-5p、miR-451a、 miR-4732-3p可以抑制細(xì)胞增殖能力。(3)miR-144-451基因簇可以抑制Wnt通路、MAPK/ERK/c-Myc信號(hào)通路。miR-144-451基因簇過(guò)表達(dá)導(dǎo)致MMP9被抑制,周期相關(guān)蛋白的p-cdc2表達(dá)升高,食管癌細(xì)胞周期、侵襲抑制可能與此有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R735.1

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本文編號(hào)：1482404