發(fā)布時(shí)間：2018-01-31 23:40

  本文關(guān)鍵詞： 胃癌 貝伐珠單抗 化學(xué)療法 給藥時(shí)序 AKT 凋亡　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在我國(guó),胃癌的發(fā)病率很高,由于胃癌篩查沒(méi)有得到普及和重視,大多數(shù)胃癌到中晚期才得到診斷,且由于胃部腫瘤原發(fā)或繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生致使腫瘤對(duì)化療不敏感,往往導(dǎo)致治療無(wú)效或失敗。近年來(lái),對(duì)腫瘤耐藥相關(guān)基因功能的研究揭示了眾多的腫瘤耐藥機(jī)制,在指導(dǎo)臨床治療中逐漸凸顯出重要的作用,然而由于揭示這些基因功能的相關(guān)研究相對(duì)獨(dú)立,還難以據(jù)此整合形成一套行之有效的治療手段。因此,目前臨床治療胃癌的方法中,化療仍是主要的治療手段。近年來(lái)研究顯示,在胃癌化療臨床藥物的選擇中,順鉑(cisplatin,CDDP)聯(lián)合氟尿嘧啶以及其衍生物仍是基礎(chǔ)化療藥物之一。“抗腫瘤血管生成”是19世紀(jì)70年代由Folkman教授提出的治療腫瘤的全新理念,是腫瘤治療領(lǐng)域的里程碑式的標(biāo)志。在此之后,貝伐珠單抗、恩度、索拉菲尼、舒尼替尼等抗血管生成類藥物相繼被研發(fā)。目前,國(guó)內(nèi)針對(duì)恩度抗血管生成藥物時(shí)間窗研究較多。而對(duì)舒尼替尼、索拉菲尼、貝伐珠單抗等抗血管生成藥物時(shí)間窗研究較少,其抗血管生成的作用機(jī)理、毒副反應(yīng)、單用還是與化療藥物聯(lián)用,如何聯(lián)用更有優(yōu)勢(shì)等方面進(jìn)行研究還有待開(kāi)展。早在2004年,貝伐珠單抗就已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市,被用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、復(fù)發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及某些腎癌。2012年,貝伐珠單抗聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)化療首次被歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)性卵巢癌。目前,有研究表明:作為人源化單克隆抗體,貝伐珠單抗中的鼠源性組成部分特異性地結(jié)合VEGF,從而阻斷其與Qg源性VEGFR的結(jié)合,進(jìn)而限制其生物學(xué)活性、抑制新生血管形成以及降低血管通透性。MGC 803是胃癌VEGF表達(dá)的細(xì)胞株。本研究對(duì)不同時(shí)序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合化療對(duì)人胃癌細(xì)胞株(MGC 803)的抑制作用進(jìn)行了分析;建立了MGC 803細(xì)胞荷瘤裸鼠模型,進(jìn)一步探討了不同時(shí)序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合化療給藥方式對(duì)胃癌荷瘤小鼠的治療效果:通過(guò)小動(dòng)物活體成像技術(shù)對(duì)抗血管生成藥物療效進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè);同時(shí)通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)、westernblot以及免疫組化技術(shù)檢測(cè),觀察vegf/akt通路及凋亡蛋白bcl-2和bax的變化和mvd,bax,bcl-2與vegfr表達(dá);分析并探討不同時(shí)序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合化療的給藥方式對(duì)胃癌荷瘤裸鼠治療的分子機(jī)制,以及貝伐珠單抗抗血管生成的時(shí)間窗問(wèn)題。第一部分不同時(shí)序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑、5-fu對(duì)人胃癌細(xì)胞株(mgc803)抑制作用及其相關(guān)機(jī)制的探究目的:研究不同時(shí)序條件下貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑、5-fu對(duì)人胃癌細(xì)胞株(mgc803)抑制作用及其機(jī)制,嘗試找到抗血管生成藥物貝伐珠單抗與細(xì)胞毒藥物的最佳聯(lián)合時(shí)序。方法:體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞mgc803,不同時(shí)序條件下,貝伐珠單抗聯(lián)合化療處理細(xì)胞,mtt法檢測(cè)mgc803細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制情況,流式細(xì)胞儀(pi染色)分析細(xì)胞周期分布相和細(xì)胞凋亡率。結(jié)果:1mtt測(cè)定不同單藥、不同濃度的胃癌細(xì)胞株mgc803的抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),進(jìn)一步做兩兩比較,各單藥不同濃度間的抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),隨著濃度的增高,抑制率逐漸增高。2mtt測(cè)定不同時(shí)序聯(lián)合給藥對(duì)胃癌細(xì)胞株mgc803的抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),進(jìn)一步做兩兩比較,抑制率最高的為fp(順鉑、5-fu)化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(68.63%),其次為fp化療前48小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(63.46%)和fp化療前72小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(62.89%),再次為fp化療同時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(60.96%)和fp化療后24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(59.64%),再次為fp化療后48小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(57.53%)和fp化療后72小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(56.63%),單純fp方案化療組最低(52.33%)。表明先給予貝伐株單抗,再給予fp化療的聯(lián)合方案對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有高效的抑制作用。3不同時(shí)序給藥對(duì)胃癌細(xì)胞株mgc803細(xì)胞周期g0/g1期和g2/m期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),s期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),進(jìn)一步做兩兩比較,s期最高的為fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(48.13),均高于其他各組(p0.05);最低的為單純fp方案化療組(23.50),均低于其他各組(p0.05),其余各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。表明fp化療前24小時(shí)給予貝伐株單抗的聯(lián)合方案明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞出現(xiàn)s期細(xì)胞阻止。4不同時(shí)序給藥的胃癌細(xì)胞株mgc803凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),進(jìn)一步做兩兩比較,凋亡率最高的為fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(4.76),其次為fp化療前48小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(3.41)、fp化療前72小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(3.32)、fp化療同時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(2.99)和fp化療后24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(2.90),再次為fp化療后48小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(2.21)、fp化療后72小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(2.57)和單純fp方案化療組(2.14)。結(jié)果表明fp化療前24小時(shí)給予貝伐株單抗的聯(lián)合方案明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。結(jié)論:1不同時(shí)序?qū)ξ赴┘?xì)胞株mgc803的抑制率不同,抑制率最高的為fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗。2不同時(shí)序給藥可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株mgc803細(xì)胞周期s期阻滯,其中fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗誘導(dǎo)s期阻滯最顯著。3不同時(shí)序給藥的胃癌細(xì)胞株mgc803凋亡率不同,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡最顯著的為fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗。第二部分利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)探討貝伐珠單抗與順鉑、5-fu不同時(shí)序給藥方式對(duì)胃癌荷瘤小鼠治療療效的影響目的:通過(guò)小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)觀察帶有熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)變化,進(jìn)一步在整體動(dòng)物水平上比較貝伐珠單抗聯(lián)合順鉑、5-fu不同時(shí)序給藥方式的抗腫瘤療效的差異。方法:采用貝伐珠單抗聯(lián)合fp方案化療不同時(shí)序給藥方式對(duì)人胃癌裸鼠皮下種植模型的腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行干預(yù)治療,通過(guò)腫瘤體積計(jì)算抑制率,熒光信號(hào)值的變化觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)分組和給藥時(shí)序如下:第一組a組為貝伐珠單抗+fp化療同時(shí)治療組;第二組b組為fp化療24小時(shí)后給予貝伐珠單抗;第三組c組為貝伐珠單抗24小時(shí)后給予fp化療;第四組d組為單藥貝伐珠單抗;第五組e組對(duì)照組,腹腔注射生理鹽水。結(jié)果:1不同組別裸鼠體重變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.219),治療后不同時(shí)間點(diǎn)體重變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),時(shí)間與組別間存在交互作用(p=0.031)。進(jìn)一步做兩兩比較,a組不同時(shí)間點(diǎn)裸鼠體重變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.773),b,c,d,e組裸鼠體重隨時(shí)間均有增加趨勢(shì)(p0.05)。2根據(jù)腫瘤體積計(jì)算各組抑瘤率分別為a組抑瘤率為40.95%,b組抑瘤率為37.57%,c組抑瘤率為68.42%,d組抑瘤率為19.84%。不同組別裸鼠腫瘤體積變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.166),治療后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.006),時(shí)間與組別間存在交互作用(p0.001),進(jìn)一步做兩兩比較,用藥前和用藥一周后不同組別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),用藥第2周和第3周不同組別差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),體積由小到大依次為c,a,b,d,e,c組體積明顯低于d組和e組(p0.05),a,b,d組不同時(shí)間點(diǎn)裸鼠腫瘤體積變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),c組裸鼠腫瘤體積隨時(shí)間呈降低趨勢(shì)(p0.05),e組裸鼠腫瘤體積隨時(shí)間呈增加趨勢(shì)(p0.05)。3不同組別裸鼠腫瘤熒光信號(hào)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),治療后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤熒光信號(hào)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001),時(shí)間與組別間存在交互作用(p0.001),進(jìn)一步做兩兩比較,用藥前不同組別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.074),用藥第1周、第2周和第3周不同組別差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),第1周和第2周,e組均高于a,b,c,d組,第3周,熒光信號(hào)由低到高依次為c,a,b,d,e組,a組、c組裸鼠腫瘤熒光信號(hào)第3周低于用藥前(p0.05),e組裸鼠腫瘤熒光信號(hào)隨時(shí)間呈增加趨勢(shì)(p0.05)。結(jié)論:1貝伐珠單抗與fp聯(lián)合,具有協(xié)同作用,且先于fp化療應(yīng)用時(shí)腫瘤抑制率最為顯著。2通過(guò)在體實(shí)驗(yàn)研究,利用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)獲得腫瘤長(zhǎng)徑和短徑以及熒光信號(hào)值,客觀敏感的發(fā)現(xiàn)腫瘤體積不再縮小的時(shí)間點(diǎn),熒光信號(hào)繼續(xù)衰減,即藥物繼續(xù)發(fā)揮著抗腫瘤作用。第三部分貝伐珠單抗與順鉑、5-fu化療不同時(shí)序給藥方式對(duì)胃癌細(xì)胞治療療效的分子機(jī)制目的:檢測(cè)不同時(shí)序貝伐珠單抗聯(lián)合fp化療處理后的人胃癌細(xì)胞株(mgc803)以及荷瘤裸鼠腫瘤組織akt,bax,bcl-2,cyclind1,p21,pi3k,mvd的表達(dá)情況,初步探究fp化療前給予貝伐珠單抗的聯(lián)合用藥時(shí)序誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞毒性作用的生物學(xué)機(jī)制,旨在進(jìn)一步為臨床上使用貝伐珠單抗聯(lián)合fp方案治療胃癌提供相應(yīng)的理論依據(jù)。方法:通過(guò)westernblot、免疫組化技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)序貝伐珠單抗聯(lián)合化療處理后,對(duì)人胃癌細(xì)胞株(mgc803)以及荷瘤裸鼠腫瘤組織中akt,bax,bcl-2,cyclind1,p21,pi3k,mvd,vegfr表達(dá)的影響。結(jié)果:1不同時(shí)序聯(lián)合給藥對(duì)胃癌細(xì)胞株mgc803相關(guān)蛋白表達(dá)的影響不同時(shí)序聯(lián)合給藥處理胃癌細(xì)胞株mgc803后:各組pi3k,akt,p21蛋白表達(dá)與單獨(dú)化療組相比較,均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。進(jìn)一步做兩兩比較,表達(dá)量最高的為fp化療組,分別為:pi3k(1.11±0.03),akt(1.27±0.09),p21(1.51±0.04);其次為fp化療后72小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗,分別為:pi3k(0.97±0.04),akt(1.13±0.10),p21(1.38±0.05),cyclind1以及fp化療后48小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗,分別為:pi3k(0.90±0.05),akt(1.04±0.12),p21(1.35±0.05);fp化療前24小時(shí)方案聯(lián)合組最低,分別為:pi3k(0.07±0.03),akt(0.02±0.01),p21(0.13±0.02),其顯著性的治療療效可能通過(guò)抑制pi3k和akt發(fā)揮作用。除fp化療前48小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗處理組外,其余各組bcl-2蛋白表達(dá)與單獨(dú)化療組相比較明顯降低,(p0.05)。進(jìn)一步做兩兩比較,表達(dá)量最高的為單純化療組(1.12±0.04),其次為fp化療后72小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(1.00±0.06)以及fp化療后24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(0.74±0.04);fp化療前24聯(lián)合貝伐珠單抗方案組最低(0.05±0.04)。各組bax蛋白表達(dá)與單獨(dú)化療組相比較,均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),進(jìn)一步做兩兩比較,表達(dá)量最高的為fp化療前72小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(1.02±0.04),其次為fp化療前48小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(0.99±0.05)以及fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗組(0.95±0.04);fp化療組最低(0.07±0.01)。各組cyclind1蛋白表達(dá)與單獨(dú)化療組相比較,均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),進(jìn)一步做兩兩比較,表達(dá)量最低的為單純化療組(0.04±0.03),其次為fp化療后72小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(0.13±0.05)以及fp化療前48小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(0.28±0.05);fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗方案組最高(0.71±0.05)。2不同時(shí)序聯(lián)合給藥對(duì)荷瘤裸鼠腫瘤組織相關(guān)蛋白表達(dá)的影響對(duì)荷瘤(胃癌細(xì)胞株mgc803)裸鼠進(jìn)行不同時(shí)序貝伐珠單抗以及化療的聯(lián)合給藥處理后:各組pi3k,akt,bcl-2蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值(od)與空白對(duì)照組相比較,均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),進(jìn)一步做兩兩比較,表達(dá)量最高的為空白對(duì)照組,分別為pi3k(0.73±0.04),akt(1.13±0.05),bcl-2(1.40±0.04),其次為fp化療后24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗pi3k(0.44±0.03),akt(0.46±0.02),bcl-2(1.14±0.04)和貝伐珠單抗單藥pi3k(0.14±0.03),akt(0.35±0.03),bcl-2(0.74±0.04),再次為fp化療聯(lián)合貝伐珠單抗同時(shí)給藥pi3k(0.09±0.03),akt(0.25±0.03),bcl-2(0.52±0.02);fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗最低pi3k(1.13±0.05),akt(0.06±0.03),bcl-2(0.19±0.02)。各組p21蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值(od)與空白對(duì)照組相比較,均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),進(jìn)一步做兩兩比較,表達(dá)量最高的為fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(0.85±0.02);其次為貝伐珠單抗單藥(0.61±0.02)和fp化療聯(lián)合貝伐珠單抗同時(shí)給藥(0.48±0.04);fp化療后24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(0.43±0.01)和空白對(duì)照組(0.43±0.03)最低。各組bax蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值(od)與空白對(duì)照組相比較,均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),進(jìn)一步做兩兩比較,表達(dá)量最高的為fp化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗組(1.27±0.03);其次為貝伐珠單抗單藥(0.85±0.04)和空白對(duì)照組(0.83±0.03);fp化療聯(lián)合貝伐珠單抗同時(shí)給藥(0.82±0.03)和fp化療后24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(0.77±0.02)最低。其中,fp化療后24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗組與fp化療同時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗組比,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著;貝伐珠單抗單藥組與空白對(duì)照組組比,差異不顯著;上述前兩組與后兩組相比,具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。各組Cyclin D1蛋白表達(dá)的相對(duì)光密度值(OD)與空白對(duì)照組相比較,均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),進(jìn)一步做兩兩比較,表達(dá)量最低的為空白對(duì)照組(0.31±0.04);其次FP化療同時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗組(0.36±0.02)和FP化療后24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗(0.46±0.02);再次為為貝伐珠單抗單藥(0.64±0.02);FP化療前24小時(shí)聯(lián)合貝伐珠單抗組最高(0.92±0.01)。結(jié)論:1從細(xì)胞水平看,FP方案化療前聯(lián)合貝伐珠單抗組,通過(guò)對(duì)MGC-803細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控:上調(diào)Bax,Cyclin D1,下調(diào)Bcl-2,P21蛋白的表達(dá)最明顯,進(jìn)而阻止腫瘤細(xì)胞增殖作用最強(qiáng);2在荷瘤小鼠上,FP化療前聯(lián)合貝伐珠單抗組具有明顯作用,上調(diào)Bax,Cyclin D1,下調(diào)Bcl-2,P21蛋白,其中FP化療前24小時(shí)聯(lián)和貝伐珠單抗組下調(diào)細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路最顯著,其抑瘤效果最理想。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1480305