本文關(guān)鍵詞： 肝癌 伴侶蛋白攜帶t復(fù)合多肽1-亞基3 含有GTP酶異亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白3 甲胎蛋白 小干擾RNA Western blot 實時定量PCR JAK/STATs信號通路 Ras/ERK1/2信號通路　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤,是與癌癥相關(guān)的第三大死亡原因,每年約導(dǎo)致696,000人死亡。雖然晚期肝癌的預(yù)后在過去20年中有了較大提高,但5年生存率仍很低,最有效的治療方法是外科切除,但是在腫瘤晚期就喪失了手術(shù)機會。超聲、CT和MRI這些傳統(tǒng)的檢查方法有助于監(jiān)測腫瘤的發(fā)生部位和是否轉(zhuǎn)移,但對早期肝癌的檢查是有限的,單獨應(yīng)用這些檢查有可能會誤診。迄今為止,甲胎蛋白(AFP)是發(fā)現(xiàn)肝癌最重要的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物,然而,將近40%的肝癌是小肝癌和AFP水平正常的肝癌。因此,發(fā)現(xiàn)一種能早期診斷肝癌并指導(dǎo)臨床治療和評價預(yù)后的因子就非常重要。分子伴侶蛋白TCP1復(fù)合物(CCT),也稱作TRi C和c-cpn,在細胞中介導(dǎo)蛋白折疊,伴侶蛋白是ATP依賴性折疊蛋白,表達在所有生物體中。他們由兩個背靠背的低聚環(huán)堆積而成,使蛋白底物結(jié)合并折疊。CCT3(60k Da)是CCT/TRi C復(fù)合物主要的亞基,在蛋白折疊和再折疊過程中特異性地發(fā)揮作用。一些研究已經(jīng)通過RT-PCR和western blot法監(jiān)測到肝癌患者中CCT3過表達,CCT3通過使轉(zhuǎn)錄因子磷酸化,并且激活進入肝癌細胞核的轉(zhuǎn)錄因子(STAT)3/STAT3而影響肝癌的進程。CCT3可能在調(diào)節(jié)微管結(jié)構(gòu)和功能(捕捉著絲粒)中發(fā)揮作用,影響細胞對這些微管靶點的敏感性。含有GTP酶異亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白3(IQGAP)家族包含三個成員:IQGAP1,IQGAP2 and IQGAP3,IQGAP3是家族中新近發(fā)現(xiàn)的。目前研究中發(fā)現(xiàn),它參與上皮細胞的增生,然而,在腫瘤發(fā)生中的作用仍不明確。IQGAP3可能通過RAS/ERK1/2途徑調(diào)節(jié)細胞增殖。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)增生的肝細胞中細胞間的連接處IQGAP3表達上調(diào)。IQGAP3相關(guān)的信號途徑可能作為復(fù)雜信號通道中的一部分參與肝細胞再生。Ras-,Rac-,和Cdc42結(jié)合IQGAP3后對肝細胞再生的作用,表明IQGAP3可能在細胞增殖和組織重建中有效地介導(dǎo)這些信號進程。本研究擬應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)進一步探討CCT3和IQGAP3在肝癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲過程中的作用。采用不同轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細胞株和非瘤肝細胞株,應(yīng)用載體轉(zhuǎn)染方法設(shè)計并合成CCT3、IQGAP3基因的小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA),將si RNA轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株干擾CCT3、IQGAP3基因的表達,觀察CCT3、IQGAP3基因表達沉默后對肝癌細胞株侵襲能力的影響,同時采用Western-blot法檢測細胞轉(zhuǎn)染前后一些信號通路的表達,目的是探討CCT3、IQGAP3對肝癌的診斷價值,為提高肝癌治療手段及改善預(yù)后提供理論依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點:1.本研究中我們首次在肝癌、肝硬化和健康人群中的血清中檢測CCT3和IQGAP3的表達,并評估其用來診斷小肝癌和AFP陰性肝癌的價值,我們的研究證明了CCT3和IQGAP3對肝癌的診斷有顯著作用,并且其表達獨立于AFP,尤其當(dāng)AFP陰性或是早期肝癌時,診斷價值非常高,因此,CCT3、IQGAP3聯(lián)合AFP能提高肝癌診斷的敏感性和特異性,2.初步探索了CCT3促進肝癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲的作用機制,提示CCT3的促腫瘤生長作用和JAK/STATs信號通路存在密切的聯(lián)系,CCT3促進肝癌侵襲作用的部分機制可能與JAK/STATs活化通路有關(guān)。3.進一步了解IQGAP3促進肝癌細胞增殖和侵襲的作用機制,提示IQGAP3的促進腫瘤細胞增殖和侵襲的作用和Ras/ERK信號通路之間關(guān)系密切,Ras家族蛋白Rac/Cdc42在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,為開展肝癌基因靶向治療奠定了理論基礎(chǔ)。第一部分CCT3、IQGAP3在肝癌血清中的表達及其與肝癌臨床指標(biāo)之間的關(guān)系目的:評價伴侶蛋白復(fù)合物TCP1亞基3(CCT3)和含有GTP酶異亮氨酸-谷氨酰胺序列激活蛋白3(IQGAP3)在肝癌患者血清中的診斷價值。方法:收集126例肝癌患者,88例肝硬化和50例健康人群的血清,通過ELISA方法檢測甲胎蛋白、CCT3和IQGAP3的水平。結(jié)果:在肝癌患者的血清中,CCT3和IQGAP3的表達與肝硬化和健康對照組相比較明顯升高,CCT3和IQGAP3蛋白水平均與肝癌患者的病因、腫瘤大小,TNM分期和Child Pugh分級有關(guān),在肝癌診斷上CCT3的敏感度優(yōu)于AFP(0.846 vs0.667),CCT3和IQGAP3蛋白可以用來診斷甲胎蛋白陰性的肝癌,其靈敏性和特異性分別為92.1%,70.5%和81.6%,71.6%。在小肝癌組,CCT3和IQGAP3蛋白的敏感性分別是76.1%和75.3%,把AFP、CCT3和IQGAP3結(jié)合起來曲線下面積為0.954,其診斷能力較單獨應(yīng)用AFP的曲線下面積0.815明顯增加(P0.01)。結(jié)論:CCT3和IQGAP3可以作為肝癌的診斷因子,尤其是在AFP陰性肝癌和小肝癌時。第二部分CCT3在肝癌細胞系侵襲中的作用及機制研究目的:研究CCT3基因在肝癌細胞的生物學(xué)作用,檢測非瘤肝細胞系及兩種肝癌細胞系中CCT3基因的表達情況,設(shè)計并合成CCT3基因的小干擾RNA(small interfering RNA,si RNA),研究CCT3在肝癌細胞系侵襲中的作用及其相關(guān)機制。方法:用Western blot方法檢測三種不同侵襲能力的細胞系中CCT3蛋白的表達情況,設(shè)計并合成CCT3基因的si RNA,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hep G2細胞及MHCC97H細胞,通過Rt PCR法和Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后三組細胞CCT3m RNA和蛋白的表達。通過transwell小室基質(zhì)侵襲實驗,應(yīng)用特異性CCT3-si RNA轉(zhuǎn)染的Hep G2及MHCC97-H細胞,觀察沉默CCT3表達之后,Hep G2及MHCC97-H肝癌細胞系侵襲能力的變化,同時采用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后兩種細胞系中STAT3和(p)STAT3的表達。結(jié)果:相比非瘤肝細胞,CCT3在MHCC97H及Hep G2兩種肝癌細胞系中均高表達。特異性CCT3-si RNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞后,通過Rt PCR和western blot的方法發(fā)現(xiàn)CCT3蛋白以及m RNA的表達均明顯降低,表明si RNA能成功的抑制CCT3的表達。應(yīng)用特異性CCT3-si RNA抑制肝癌細胞系中CCT3的表達,transwell小室基質(zhì)侵襲實驗結(jié)果顯示:CCT3-si RNA組兩組肝癌細胞系穿膜的細胞數(shù)目顯著減少。Western blot實驗檢測發(fā)現(xiàn),CCT3-si RNA組兩種細胞的STAT3和(p)STAT3的表達均降低。結(jié)論:CCT3在肝癌侵襲過程中起了調(diào)控作用,CCT3-si RNA抑制了兩種肝癌細胞系的侵襲能力,下調(diào)了STAT3和(p)STAT3的表達,CCT3可能通過調(diào)控JAK/STATs信號通路來影響肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。第三部分IQGAP3在肝癌細胞系侵襲中的作用及機制研究目的:明確IQGAP3在促進肝癌細胞侵襲和增殖過程中的作用及機制,為探明肝癌的發(fā)病分子機制并探求新的分子靶向治療靶點奠定理論基礎(chǔ)。方法:經(jīng)Western-Blot、q RT-PCR方法分析,下調(diào)肝癌細胞株中IQGAP3表達后Ras、ERK1/2的變化,通過Transwell法研究細胞遷移、侵襲能力變化;MTT法檢測細胞增殖能力變化。結(jié)果:IQGAP3在MHCC97H肝癌細胞系中較非瘤肝細胞細胞表達水平較高,差異有顯著性(P0.01)。通過western blot和實時定量PCR的方法檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)特異性地將IQGAP3-si RNA轉(zhuǎn)染兩種肝癌細胞后,IQGAP3蛋白以及m RNA的表達均顯著下降,表明si RNA能成功的抑制IQGAP3的表達。通過Transwell和MTT法檢測結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染IQGAP3-si RNA的肝癌細胞,侵襲能力和增殖能力同時下降。我們進一步分析探討存在的可能機制,應(yīng)用western blot法,研究Ras和ERK1/2蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后,表達較對照組明顯下降。結(jié)論:初步探討了IQGAP3的表達對肝癌細胞在體外的生物學(xué)行為的影響,發(fā)現(xiàn)IQGAP3能促進肝癌細胞增殖、侵襲,其分子機制可能是通過激活Ras/ERK1/2信號通路。
[Abstract]:Although the prognosis of advanced liver cancer has increased significantly in the past 20 years , it is very important to find a factor which can be used for the early diagnosis of liver cancer and to guide the clinical treatment and prognosis . The results showed that the sensitivity and specificity of CCT3 and IQgap3 were 76.1 % , 70.5 % and 81.6 % , 71.6 % , respectively . The results showed that the sensitivity and specificity of CCT3 and IQgap3 were 92.1 % , 70.5 % and 81.6 % , 71.6 % respectively . The expression of CCT3 protein was detected by Western blot and Western blot . The results showed that CCT3 - si RNA could inhibit the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells . The results showed that the expression of the cells , invasion ability and proliferation ability of liver cancer cells transfected with IQgap3 - si RNA were decreased . The results showed that the expression of IQgap3 could promote the proliferation and invasion of hepatocellular carcinoma cells . The molecular mechanism of the cells might be by activating the Ras / ERK / 2 signal pathway .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

【參考文獻】

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本文編號：1476634