發(fā)布時間：2018-01-29 13:08

  本文關鍵詞： 異硫 酸鹽 促進 霉素 誘導 人骨 肉瘤 細胞 凋亡 實驗 研究　出處：《廣西醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：本文旨在探討異硫氰酸鹽與阿霉素在體外聯合作用人骨肉瘤細胞(U2-OS)后對細胞凋亡的影響,證明異硫氰酸鹽能促進阿霉素誘導U2-OS細胞凋亡,并討論其可能的作用機制,為骨肉瘤的臨床治療提供一定的參考。方法：將凍存的U2-OS細胞復蘇培養(yǎng)后鏡下觀察拍照,了解細胞活性,并選取第二代生長良好的U2-OS細胞作為實驗對象；分別以lug/ml、 2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、25ug/ml濃度的阿霉素和2uM/ml,4uM/ml,8uM/ml,16uM/ml,32uM/ml,64uM/ml濃度的異硫氰酸鹽單獨作用于呈對數期生長的U2-OS細胞,檢測藥物對細胞增殖抑制率的影響,計算IC50的數值；然后將lug/ml、3ug/ml、10ug/ml的阿霉素分別與2uM/ml、 2.5uM/ml、4uM/ml、的異硫氰酸鹽聯合作用于U2-OS細胞24h后,MTT法進行細胞抑制率的測算,并繪制抑制率與濃度直方圖,計算Q值來評估兩藥聯合作用的效應,得到最佳的藥物作用濃度；根據最佳作用濃度,隨機將細胞分為空白組、阿霉素組、異硫氰酸鹽組及聯合用藥組四組,作用24小時后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率,比較各組細胞凋亡率的變化情況；同樣根據最佳作用濃度,以相同的分組方法檢測caspase3因子的活性情況及用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡,比較各組細胞凋亡率的變化情況,并與流式細胞儀結果比較看變化的趨勢是否一致；在作用機制的探討中我們先選用AAH-APO-1芯片(細胞凋亡抗體芯片)來檢測相關的凋亡因子,隨機將培養(yǎng)好的細胞分為4組,分別為空白組、阿霉素組、異硫氰酸鹽組及聯合用藥組,藥物作用24小時后用芯片檢測約40種較常見的細胞凋亡因子,選取其中變化最大的因子作為我們下一步的研究對象,并了解他們之間的關系；Real time PCR法檢測四組細胞中Caspase3、caspase9、Bc1-2及Bax的mRNA表達量,對比各組的結果；Western blotting檢測四組細胞中Caspase3、caspase9、Bcl-2及Bax蛋白表達量,比較各組之間的結果,并與細胞凋亡抗體芯片及Real time PCR的結果比較看因子的變化趨勢是否一致。結果：復蘇后的細胞按常規(guī)方法培養(yǎng),二代細胞可在48小時之內貼壁,細胞生長迅速,排列緊密,活性良好,可作為實驗對象；MTT法檢測可知阿霉素和異硫氰酸鹽藥物濃度的增大,腫瘤細胞抑制率隨之增高,阿霉素IC50=10.322ug/ml,異硫氰酸鹽的IC50=5.33uM/L;兩藥聯合作用后MTT檢測阿霉素3ug/ml與異硫氰酸鹽2.5uM/ml配對時U2-OS細胞的抑制率為70.482%,Q值1.886,表明兩藥協調作用最好,選擇此濃度作為我們下一步研究的藥物作用濃度；將培養(yǎng)好的U2-OS細胞隨機分為4組,分別為空白組,阿霉素(3ug/ml)組、異硫氰酸鹽(2.5uM/ml)組、阿霉素(3ug/ml)+異硫氰酸鹽(2.5uM/ml)組,藥物作用24小時后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率(我們以早期凋亡率的結果來比較),空白組凋亡率(%)3.2士0.6,阿霉素(3ug/ml)組凋亡率(%)8.5±2.3,異硫氰酸鹽組凋亡率(%)9.2±3.1,阿霉素(3ug/ml)+異硫氰酸鹽(2.5uM/ml)組組凋亡率(%)35.2±7.9,聯合用藥組與空白組和單獨用藥組比較(用SPSS16.0軟件分析,n=10)細胞凋亡率有顯著差異(p0.05),凋亡率明顯增高；同樣的分組方法,Caspase3活性檢測結果聯合用藥組為42.86±10.376,較空白組5.48±2.153、阿霉素(3ug/ml)組13.62±4.874、異硫氰酸鹽(2.5uM/ml)組10.56+4.162明顯增高(p0.05,n=3),caspase3作為凋亡的終末執(zhí)行因子,與細胞凋亡呈正相關,與流式細胞儀檢測的結果基本一致；TUNEL染色法檢測U2-OS細胞凋亡,空白組中的早期凋亡細胞非常少,阿霉素組凋亡率(%)為6.5±2.16,,異硫氰酸鹽組凋亡率(%)為7.3±2.47,聯合用藥組凋亡率(%)為38.64±11.35,聯合用藥組與空白組和單獨用藥組比較(用SPSS 16.0軟件分析,n=5)細胞凋亡率有顯著差異(p0.01),凋亡率明顯增高；AAH-APO-1芯片結果提示Caspase3、 caspase9及Bax聯合用藥組叫空白組及單獨用藥組顯著增高,而Bcl-2聯合用藥組叫其他三組顯著降低,另外與Bcl-2家族有密切關系的XIAP因子呈高表達,但聯合用藥組與其它三組比較變化不是十分明顯；RT-PCR結果提示Caspase3、caspase9及Bax空白組表達量較低,而聯合用藥組顯著增高,Bcl-2則相反,空白組呈高表達,聯合用藥組顯著減少；Western blotting檢測結果與RT-PCR結果基本相符,Caspase3、caspase9及Bax聯合用藥組顯著增高,其中以Caspase3變化幅度最大,Bcl-2聯合用藥組較空白組顯著降低。結論：1：異硫氰酸鹽與阿霉素聯合作用后對細胞增殖有協調作用。2：在體外較低的藥物濃度下異硫氰酸鹽能促進阿霉素誘導人骨肉瘤細胞U2-OS的凋亡作用。3：異硫氰酸鹽聯合阿霉素可能是通過調節(jié)Bcl-2家族凋亡因子來促進凋亡。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of isothiocyanates and adriamycin on the apoptosis of human osteosarcoma cells ( U2 - OS ) in vitro . The apoptosis rate ( % ) , apoptosis rate ( % ) of Caspase - 3 , caspase9 , Bcl - 2 and Bax in four groups of cells were detected by MTT assay . The results showed that the inhibition rates of Caspase - 3 , caspase9 , Bcl - 2 and Bax in four groups of cells were determined by MTT assay . The apoptosis rate ( % ) of caspase - 3 , caspase9 and Bax was significantly higher than that in blank group ( P < 0.01 ) .

【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R738.1

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本文編號：1473490