本文關(guān)鍵詞： 異硫 酸鹽 促進(jìn) 霉素 誘導(dǎo) 人骨 肉瘤 細(xì)胞 凋亡 實(shí)驗(yàn) 研究　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：本文旨在探討異硫氰酸鹽與阿霉素在體外聯(lián)合作用人骨肉瘤細(xì)胞(U2-OS)后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,證明異硫氰酸鹽能促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)U2-OS細(xì)胞凋亡,并討論其可能的作用機(jī)制,為骨肉瘤的臨床治療提供一定的參考。方法：將凍存的U2-OS細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)后鏡下觀察拍照,了解細(xì)胞活性,并選取第二代生長(zhǎng)良好的U2-OS細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象；分別以lug/ml、 2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、25ug/ml濃度的阿霉素和2uM/ml,4uM/ml,8uM/ml,16uM/ml,32uM/ml,64uM/ml濃度的異硫氰酸鹽單獨(dú)作用于呈對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的U2-OS細(xì)胞,檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響,計(jì)算IC50的數(shù)值；然后將lug/ml、3ug/ml、10ug/ml的阿霉素分別與2uM/ml、 2.5uM/ml、4uM/ml、的異硫氰酸鹽聯(lián)合作用于U2-OS細(xì)胞24h后,MTT法進(jìn)行細(xì)胞抑制率的測(cè)算,并繪制抑制率與濃度直方圖,計(jì)算Q值來(lái)評(píng)估兩藥聯(lián)合作用的效應(yīng),得到最佳的藥物作用濃度；根據(jù)最佳作用濃度,隨機(jī)將細(xì)胞分為空白組、阿霉素組、異硫氰酸鹽組及聯(lián)合用藥組四組,作用24小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,比較各組細(xì)胞凋亡率的變化情況；同樣根據(jù)最佳作用濃度,以相同的分組方法檢測(cè)caspase3因子的活性情況及用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡,比較各組細(xì)胞凋亡率的變化情況,并與流式細(xì)胞儀結(jié)果比較看變化的趨勢(shì)是否一致；在作用機(jī)制的探討中我們先選用AAH-APO-1芯片(細(xì)胞凋亡抗體芯片)來(lái)檢測(cè)相關(guān)的凋亡因子,隨機(jī)將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為4組,分別為空白組、阿霉素組、異硫氰酸鹽組及聯(lián)合用藥組,藥物作用24小時(shí)后用芯片檢測(cè)約40種較常見的細(xì)胞凋亡因子,選取其中變化最大的因子作為我們下一步的研究對(duì)象,并了解他們之間的關(guān)系；Real time PCR法檢測(cè)四組細(xì)胞中Caspase3、caspase9、Bc1-2及Bax的mRNA表達(dá)量,對(duì)比各組的結(jié)果；Western blotting檢測(cè)四組細(xì)胞中Caspase3、caspase9、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)量,比較各組之間的結(jié)果,并與細(xì)胞凋亡抗體芯片及Real time PCR的結(jié)果比較看因子的變化趨勢(shì)是否一致。結(jié)果：復(fù)蘇后的細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng),二代細(xì)胞可在48小時(shí)之內(nèi)貼壁,細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,排列緊密,活性良好,可作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象；MTT法檢測(cè)可知阿霉素和異硫氰酸鹽藥物濃度的增大,腫瘤細(xì)胞抑制率隨之增高,阿霉素IC50=10.322ug/ml,異硫氰酸鹽的IC50=5.33uM/L;兩藥聯(lián)合作用后MTT檢測(cè)阿霉素3ug/ml與異硫氰酸鹽2.5uM/ml配對(duì)時(shí)U2-OS細(xì)胞的抑制率為70.482%,Q值1.886,表明兩藥協(xié)調(diào)作用最好,選擇此濃度作為我們下一步研究的藥物作用濃度；將培養(yǎng)好的U2-OS細(xì)胞隨機(jī)分為4組,分別為空白組,阿霉素(3ug/ml)組、異硫氰酸鹽(2.5uM/ml)組、阿霉素(3ug/ml)+異硫氰酸鹽(2.5uM/ml)組,藥物作用24小時(shí)后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率(我們以早期凋亡率的結(jié)果來(lái)比較),空白組凋亡率(%)3.2士0.6,阿霉素(3ug/ml)組凋亡率(%)8.5±2.3,異硫氰酸鹽組凋亡率(%)9.2±3.1,阿霉素(3ug/ml)+異硫氰酸鹽(2.5uM/ml)組組凋亡率(%)35.2±7.9,聯(lián)合用藥組與空白組和單獨(dú)用藥組比較(用SPSS16.0軟件分析,n=10)細(xì)胞凋亡率有顯著差異(p0.05),凋亡率明顯增高；同樣的分組方法,Caspase3活性檢測(cè)結(jié)果聯(lián)合用藥組為42.86±10.376,較空白組5.48±2.153、阿霉素(3ug/ml)組13.62±4.874、異硫氰酸鹽(2.5uM/ml)組10.56+4.162明顯增高(p0.05,n=3),caspase3作為凋亡的終末執(zhí)行因子,與細(xì)胞凋亡呈正相關(guān),與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果基本一致；TUNEL染色法檢測(cè)U2-OS細(xì)胞凋亡,空白組中的早期凋亡細(xì)胞非常少,阿霉素組凋亡率(%)為6.5±2.16,,異硫氰酸鹽組凋亡率(%)為7.3±2.47,聯(lián)合用藥組凋亡率(%)為38.64±11.35,聯(lián)合用藥組與空白組和單獨(dú)用藥組比較(用SPSS 16.0軟件分析,n=5)細(xì)胞凋亡率有顯著差異(p0.01),凋亡率明顯增高；AAH-APO-1芯片結(jié)果提示Caspase3、 caspase9及Bax聯(lián)合用藥組叫空白組及單獨(dú)用藥組顯著增高,而Bcl-2聯(lián)合用藥組叫其他三組顯著降低,另外與Bcl-2家族有密切關(guān)系的XIAP因子呈高表達(dá),但聯(lián)合用藥組與其它三組比較變化不是十分明顯；RT-PCR結(jié)果提示Caspase3、caspase9及Bax空白組表達(dá)量較低,而聯(lián)合用藥組顯著增高,Bcl-2則相反,空白組呈高表達(dá),聯(lián)合用藥組顯著減少；Western blotting檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本相符,Caspase3、caspase9及Bax聯(lián)合用藥組顯著增高,其中以Caspase3變化幅度最大,Bcl-2聯(lián)合用藥組較空白組顯著降低。結(jié)論：1：異硫氰酸鹽與阿霉素聯(lián)合作用后對(duì)細(xì)胞增殖有協(xié)調(diào)作用。2：在體外較低的藥物濃度下異硫氰酸鹽能促進(jìn)阿霉素誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS的凋亡作用。3：異硫氰酸鹽聯(lián)合阿霉素可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族凋亡因子來(lái)促進(jìn)凋亡。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of isothiocyanates and adriamycin on the apoptosis of human osteosarcoma cells ( U2 - OS ) in vitro . The apoptosis rate ( % ) , apoptosis rate ( % ) of Caspase - 3 , caspase9 , Bcl - 2 and Bax in four groups of cells were detected by MTT assay . The results showed that the inhibition rates of Caspase - 3 , caspase9 , Bcl - 2 and Bax in four groups of cells were determined by MTT assay . The apoptosis rate ( % ) of caspase - 3 , caspase9 and Bax was significantly higher than that in blank group ( P < 0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R738.1

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本文編號(hào)：1473490