本文關(guān)鍵詞： Spata6 睪丸生殖細(xì)胞腫瘤 凋亡 Bax Bac-L　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：隨著社會的發(fā)展,惡性腫瘤的發(fā)病率越來越高,已經(jīng)成為威脅全世界人類健康和生命的最重要的原因之一。據(jù)統(tǒng)計在15～35歲青年男性中,睪丸癌是最常見的惡性腫瘤之一。近些年來,睪丸癌在全球發(fā)病率明顯有逐漸增加的趨勢,據(jù)統(tǒng)計睪丸癌的發(fā)病率以每年1%-2%的速度增長。在我國,睪丸癌的發(fā)病率及死亡率平均在1/10萬左右。與其他腫瘤相比,雖然睪丸癌的發(fā)病率低,但惡性率較高。在睪丸腫瘤中,95%腫瘤為睪丸生殖細(xì)胞腫瘤(Testicular germ cell tumors, TGCTs)。據(jù)報道,男性不育是TGCTs的一種臨床危險因素。據(jù)美國的研究調(diào)查顯示,最近25年來睪丸癌的罹率顯著增加,增加的比例與同期男性不育癥增加的比例十分相似。通過大樣本案例的追蹤發(fā)現(xiàn),特發(fā)性少弱畸精子癥的男性,罹患生殖細(xì)胞腫瘤的幾率比一般人高出20倍。經(jīng)過多年以來的研究分析,雖然我們對腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究越來越細(xì)致,累計了大量的臨床資料和實驗資料,但是我們至今沒有解決腫瘤起源的問題。而通過腫瘤細(xì)胞胚胎性起源假說可以解決這個問題,其表示腫瘤細(xì)胞來源于胚胎,因此,從腫瘤的來源方面為我們在抗腫瘤研究中提供了新方向和新思路。隨著分子腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、實驗胚胎學(xué)、免疫胚胎學(xué)、實驗?zāi)[瘤學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展,有利于研究者們更深入的分析胚胎發(fā)育與腫瘤生成之間的聯(lián)系,并且當(dāng)前大量的研究均表明這兩者間聯(lián)系十分密切�！澳[瘤的胚胎源性”理論指出腫瘤細(xì)胞發(fā)源自腫瘤干細(xì)胞,而原始生殖細(xì)胞來源于胚胎生殖干細(xì)胞,同樣具有遷移、增殖性和分化性。實驗結(jié)果顯示：在一定的環(huán)境中,腫瘤細(xì)胞與受精卵能夠互變互通,腫瘤細(xì)胞能夠類似于受精卵發(fā)育產(chǎn)生胚胎,而把動物的受精卵移植到睪丸內(nèi)則可形成畸胎瘤。它們在基因水平上、蛋白水平上、生物學(xué)行為上有著很多的相似性。Spata6 (spermatogenesis associated protein 6)基因是一個進(jìn)化保守的睪丸特異性基因,如同Spatal、Spata3等,也是一個精子發(fā)生相關(guān)的基因,Spata6基因由15個外顯子組成,編碼488個氨基酸的蛋白。Spata6失活可能導(dǎo)致男性不育和無頭精子癥。它特異性表達(dá)在單倍體的生殖細(xì)胞中�；谝陨媳尘�,考慮到睪丸生殖細(xì)胞腫瘤與精子均可認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞源性的產(chǎn)物,我們推測Spata 6很可能通過參與TGCTs。為了證明這個假設(shè),本實驗通過上調(diào)和下調(diào)Spata6,研究和了解其對人類胚胎癌細(xì)胞衍生細(xì)胞系NTERA-2細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及下游蛋白變化,旨在探討Spata6是否參與睪丸腫瘤細(xì)胞凋亡過程。細(xì)胞凋亡指的是為了使內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)態(tài),在相關(guān)基因的調(diào)控下細(xì)胞發(fā)生有序的、自主的死亡。其不同于細(xì)胞壞死,細(xì)胞凋亡為主動過程,該過程中能夠活化、調(diào)控及表達(dá)相應(yīng)的基因；并且該現(xiàn)象不是表示細(xì)胞自體受損,而是屬于細(xì)胞為了更好的與生存環(huán)境相適應(yīng),進(jìn)而表現(xiàn)出的一種主動的死亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡參與了癌癥的起始過程,并對癌癥的發(fā)生起負(fù)調(diào)控作用,與其有著密切關(guān)系。另一方面凋亡與男性不育癥也有著密切的關(guān)系。精子凋亡與男性不育癥之間也存在著非常明確的關(guān)系,可以影響到男性的精液量、精子密度,精子活率、畸形率等。研究發(fā)現(xiàn)P53、Bcl-2家族等調(diào)節(jié)因子在細(xì)胞凋亡、精子發(fā)生等過程中具有重要的作用,尤其是Bcl-2家族將會發(fā)揮關(guān)鍵的功能,也是當(dāng)前相關(guān)領(lǐng)域研究者重點關(guān)注的研究內(nèi)容。在Bcl-2家族內(nèi)bax是代表性最強(qiáng)的促凋亡基因,Bcl-2是代表性最強(qiáng)的抑制凋亡基因。在腫瘤細(xì)胞中,表達(dá)的Bax水平降低,但Bcl-2水平上升。因此,對Bax進(jìn)行下調(diào)或?qū)cl-2水平進(jìn)行上調(diào)可對很多腫瘤細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮抑制效應(yīng)。反之,對Bax水平進(jìn)行上調(diào)、Bcl-2水平下調(diào)對腫瘤細(xì)胞凋亡過程能夠發(fā)揮促進(jìn)效應(yīng)。因此,我們推測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (+)-Spata6和Spata6沉默序列siRNA后影響了相關(guān)凋亡基因Bax或Bcl-2的表達(dá),從而導(dǎo)致了睪丸腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖活性發(fā)生了變化。研究目的：本實驗是為了解Spata6對人類胚胎癌細(xì)胞衍生細(xì)胞系人睪丸畸胎瘤細(xì)胞NTERA-2(Testicular embryonal carcinoma cells)細(xì)胞增殖和凋亡的影響以及Spata6蛋白表達(dá)變化對其下游蛋白變化的影響,探討Spata6是否參與睪丸腫瘤細(xì)胞的凋亡,探究其發(fā)生的作用機(jī)制和途徑,進(jìn)一步揭示男性不育癥與睪丸惡性腫瘤的關(guān)系。從精子發(fā)育生物學(xué)的角度認(rèn)識睪丸腫瘤,并對精子發(fā)育和睪丸腫瘤發(fā)生之間聯(lián)系的進(jìn)一步研究,有利于我們深入地理解兩種生命現(xiàn)象的內(nèi)涵,并補(bǔ)充“腫瘤的胚胎源性”這一含義。幫助相關(guān)領(lǐng)域的研究者回歸到生命現(xiàn)象中去探討睪丸腫瘤的相關(guān)問題,找出睪丸腫瘤發(fā)生過程的薄弱環(huán)節(jié)和靶基因進(jìn)行干預(yù),為尋找新的靶基因提供基礎(chǔ)研究,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TGCTs潛在的藥物治療方法。1.通過分別將Spata6基因序列的真核表達(dá)載體PcDNA3.1重組入NTERA-2細(xì)胞以及利用siRNA技術(shù)將Spata6沉默序列siRNA轉(zhuǎn)染NTERA2細(xì)胞后,使用蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測Spata6蛋白的表達(dá)量,研究上調(diào)和下調(diào)Spata6基因?qū)pata6蛋白表達(dá)變化的影響。2.通過分別將Spata6基因序列的真核表達(dá)載體PcDNA3.1重組入NTERA-2細(xì)胞以及利用siRNA技術(shù)將Spata6沉默序列siRNA轉(zhuǎn)染NTERA-2細(xì)胞后,運用MTT法細(xì)胞增殖實驗研究分析Spata6基因表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)后對NTERA-2細(xì)胞生長活力的影響。3.通過分別將Spata6基因序列的真核表達(dá)載體PcDNA3.1重組入NTERA-2細(xì)胞以及利用siRNA技術(shù)將Spata6沉默序列siRNA轉(zhuǎn)染NTERA-2細(xì)胞后,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)研究分析Spata6基因表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)后對NTERA-2細(xì)胞凋亡的影響。4.通過分別將Spata6基因序列的真核表達(dá)載體PcDNA3.1重組入NTERA-2細(xì)胞以及利用siRNA技術(shù)將Spata6沉默序列siRNA轉(zhuǎn)染NTERA-2細(xì)胞后,使用蛋白質(zhì)免疫印跡的方法分析細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)量,分析研究Spata6對NTERA-2細(xì)胞Bax和Bcl-2表達(dá)的影響,探討上調(diào)和下調(diào)Spata6基因?qū)TERA-2細(xì)胞凋亡影響的機(jī)制。5.NTERA-2細(xì)胞移植到裸鼠皮下成瘤,使用EntransterTM-in vivo動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染方法干擾Spata6在小鼠腫瘤內(nèi)表達(dá),觀察小鼠體內(nèi)腫瘤體積和重量的變化,了解下調(diào)Spata6對睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的影響。研究方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)和實驗方案本研究選擇全球一致認(rèn)可的-NTERA2細(xì)胞系(Testicular embryonal carcinoma cells)。培養(yǎng)后隨機(jī)的分為四組：(1)正常對照組；NTERA-2細(xì)胞正常培養(yǎng)組。(2)Spata6c組,轉(zhuǎn)染Spata6基因真核表達(dá)載體PcDNA3.1的NTERA-2細(xì)胞組：(3)siSpata6c組；Spata6沉默序列siRNA轉(zhuǎn)染后的NTERA-2細(xì)胞組；(4)Spata6c+siSpata6c組,1：1比例組合(2)和(3)。2.質(zhì)粒和siRNA的設(shè)計構(gòu)建和轉(zhuǎn)染①通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增NTERA-2 cDNA的Spata6基因,將模板和片段構(gòu)建到pcDNA3.1 (+).然后將重組表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)-Spata6轉(zhuǎn)染NTERA-2細(xì)胞。②設(shè)計和合成Spata6沉默序列siRNA并將其轉(zhuǎn)染NTERA-2細(xì)胞。3.細(xì)胞增殖實驗檢測細(xì)胞增殖活力分別在轉(zhuǎn)染后24小時,48小時,72小時,和96小時收獲細(xì)胞,通過MTT比色法測定各時間段各組細(xì)胞的增殖活力。4.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡情況流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析各組細(xì)胞的凋亡情況。并使用CellQuest 3軟件分析測定結(jié)果。5.蛋白質(zhì)免疫印跡分析通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗分析各組Spata6、Bax和Bac-L的蛋白的表達(dá)情況。6.荷瘤鼠實驗建立小鼠NTERA-2腫瘤模型,使用ntransterTM-in vivo動物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑將Spata6 siRNA注射到小鼠腫瘤內(nèi),觀察腫瘤生長情況,每間隔7天測量小鼠腫瘤體積,21天后取出腫瘤測量體積并稱重。結(jié)果：1.在NTERA-2中,轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體和siRNA對Spata6蛋白表達(dá)的影響。在NTERA-2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染24小時后,Spata6c組Spata6蛋白的表達(dá)相比對照組和Spata6c+sipata6c組顯著增加(P0.05)。另外,siSpata6c組的NTERA-2細(xì)胞中Spata6蛋白質(zhì)的表達(dá)與對照組相比則顯著減少(P0.05)。2.在NTERA-2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體和siRNA對細(xì)胞增值活力的影響。經(jīng)MTT測定,在轉(zhuǎn)染后第24小時,三個組的細(xì)胞活力無明顯差異。轉(zhuǎn)染24小時后,與對照組相比,siSpata6c組的細(xì)胞增殖活性明顯下降,而Spata6c組細(xì)胞增殖活性則明顯升高(P0.05)。3.在NTERA-2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體和siRNA對細(xì)胞凋亡的影響。轉(zhuǎn)染后48小時,對照組、Spata6c組、Spata6c+siSpata6c組之間細(xì)胞凋亡率無明顯差異(P0.5)。而相對于以上三組,siSpata6c組細(xì)胞的調(diào)亡率顯著升高(P0.05)。4.在NTERA-2細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體和siRNA對細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。相對于對照組和siSpata6c組,Spata6c組的Bax的表達(dá)顯著升高,而Bcl-2的表達(dá)則明顯降低。但是對照組與siSpata6c組相比,Bax和Bcl-2的表達(dá)無明顯差異。5.Spata6siRNA組腫瘤瘤重顯著輕于Control siRNA組對照組和生理緩沖液組(P0.05),體積的差異趨勢與瘤重一致。21天后處死裸鼠后,Spata6siRNA組小鼠的腫瘤體積顯著小于control siRNA組對照組和生理緩沖液組。結(jié)論：在TGCTs細(xì)胞中,經(jīng)蛋白質(zhì)免疫印跡分析,通過轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒載體pcDNA3.1 (+)-Spata6和Spata6沉默序列siRNA可以相應(yīng)的上調(diào)和下調(diào)Spata6蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示相比于對照組,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒載體pcDNA3.1 (+)-Spata6組的TGCTs細(xì)胞Spata6的蛋白水平顯著升高了,而Spata6沉默序列siRNA轉(zhuǎn)染組的TGCTs細(xì)胞的Spata6的蛋白水平則明顯降低,并具有統(tǒng)計學(xué)意義。這表明重組質(zhì)粒被成功表達(dá)。為了探討轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞增殖和凋亡的影響,我們分別使用了MTT法和流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的增殖活性和凋亡。在細(xì)胞增殖活性方面,相比對照組,我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染Spata6沉默序列siRNA后的細(xì)胞存活率顯著下降,而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (+)-Spata6的細(xì)胞的存活率則明顯上升。另外相對于其他組,轉(zhuǎn)染siRNA抑制Spata6基因的表達(dá)后細(xì)胞的凋亡率明顯提高,這顯示下調(diào)Spata6基因的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外為了證實細(xì)胞凋亡是由Spata6表達(dá)下降引起的,我們探討了轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 (+)-Spata6和Spata6沉默序列siRNA后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。在許多腫瘤細(xì)胞中,細(xì)胞凋亡是由Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)的。Bcl-2家族是由許多抗凋亡和促凋亡的成員蛋白組成的。其中Bcl-2是一種抗凋亡蛋白,Bax則是一種促凋亡蛋白。我們的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染Spata6沉默序列siRNA后,Bax的表達(dá)顯著升高,而Bcl-2蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了顯著下降。在小鼠體內(nèi)的實驗結(jié)果和細(xì)胞學(xué)的實驗結(jié)果一致,Spata6基因沉默NTERA-2細(xì)胞的成瘤能力相比對照組細(xì)胞顯著降低。這表明對下調(diào)Spata6能通過Bax和Bcl-2促進(jìn)TGCTs細(xì)胞的凋亡。綜上所述,下調(diào)Spata6可以通過增加凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)來降低細(xì)胞活力和細(xì)胞生存,致TGCTs細(xì)胞株體外凋亡,本研究初步揭示Spata6有作為治療TGCTs腫瘤的靶標(biāo)的潛力,并且它也有可能在男性不育癥的發(fā)生中起到重要的作用,這為以后進(jìn)一步進(jìn)行動物體內(nèi)研究以及更深層次的臨床研究提供了重要的依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.21

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