本文關鍵詞： RSK4 變異體 乳腺癌 相互作用蛋白 串聯(lián)親和純化 CCK-8　出處：《廣西醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究目的：乳腺癌,一個人們聞之色變的名詞,根據(jù)最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù),在中國每年的新診斷出的乳腺癌病例及死亡病例分別占全球的12.2%和9.6%[1],這一數(shù)值的持續(xù)升高,加速著我們對乳腺癌研究的不斷深入。Berns[2]及SUN Y[3]等人先后證明了,RSK4 (p90核糖體蛋白S6激酶4,P90 Ribosomal S6 kinase 4)是抑制乳腺癌侵襲轉移的重要因子,它能夠抑制乳腺癌細胞的生長并誘導其衰老,但對于其通過mRNA可變剪接作用下行成的RSK4的變異體(RSK4 variants, RSK4m)我們卻知之甚少。由于RSK4的第19外顯子發(fā)生15個堿基的缺失突變(-15nt)和第21外顯子的缺失突變(-E21),造成其自由組合形成了三種變異體①缺少倒數(shù)第二個外顯子,即+15nt-E21(變異體1)；②缺少第19個外顯子的前15個堿基,即-15nt+E21(變異體2)；③缺少第19個外顯子的前15個堿基和倒數(shù)第二個外顯子,即-15nt-E21(變異體3)。我們這篇文章針對的是新發(fā)現(xiàn)的RSK4變異體,對它們的研究尚處于起步階段,特別是其與野生型RSK4的功能差異,是相同還是截然相反,我們都不了解,如果丟失了抑制功能,那是否可以作為新的靶向治療標記,若是能力相同同為抑制,那是具有一樣的機制導致的還是有著不同的作用機理,哪種更容易調(diào)控對腫瘤細胞的侵襲轉移的影響。本研究旨在尋找RSK4m的相互作用蛋白,以便于為后續(xù)研究其分子機制及在乳腺癌中的功能做鋪墊。研究方法：分別構建帶有兩個Strep-Ⅱ標簽和一個flag標簽[4](串聯(lián)親和純化標簽)的RSK4變異體2(RSK4m2)和RSK4變異體3 (RSK4m3)的過表達慢病毒,穩(wěn)定轉染至乳腺癌MDA-MB-231細胞中,使用蛋白印跡實驗(Western Blot)與實時熒光定量PCR (Real-time fluorogenic quantitatice PCR)檢測變異體的蛋白及mRNA的表達情況,通過串聯(lián)親和純化蛋白后進行質(zhì)譜鑒定,再通過生物信息學分析找出互作蛋白,然后通過免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, CO-IP)從結果中挑選出的熱休克蛋白HSP90aa1與RSK4m2的相互作用關系進行驗證[5]。最后用CCK-8試劑盒檢測轉染后乳腺癌MDA-MB-231細胞的生長增殖情況[6]。研究結果：本研究通過以兩個Strep II標簽和一個FLAG標簽為基礎的串聯(lián)親和純化技術(SF-TAP)聯(lián)合nano LC-MS/MS質(zhì)譜技術分別分離和鑒定出452個與RSK4m2相關的蛋白,713個RSK4m3相關的蛋白。GO分析結果：RSK4m2或RSK4m3的互作蛋白參與細胞的多種生理活動,IPA分析結果：得到RSK4m2和RSK4m3的富集度最高的蛋白互作網(wǎng)絡,其中RSK4m2與HSP90aa1存在著直接相互作用關系。結果表明兩種變異體參與了多種細胞活動,并擁有多種不同的生物學功能。同時,CO-IP證實了HSP90aa1與RSK4m2存在相互作用關系。CCK-8結果顯示過表達RSK4m2組、過表達RSK4m3組在24、48、72、96h的細胞抑制率(%)分別達到了3.9±0.01、5.6±0.01、31.1±0.01、23.6±0.02；1.5±0、4.4±0.03、22.1±0.05、19.7+0.02,在48、72、96h的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。研究結論：RSK4m2和RSK4m3可更強地抑制乳腺癌細胞株MDA-MB-231的增殖,結果表明RSK4m可能有抑制乳腺癌細胞增殖的功能,但可能與RSK4野生型(RSK4w)存在著不同的調(diào)控機制,RSK4m可能比RSK4w擁有更多的生物功能,RSKm2可能是通過抑制HSP90aa1來阻礙癌細胞的生長,但其中的具體功能尚有待更深入的研究。
[Abstract]:Objective: breast cancer, a dreaded noun, according to the latest statistics, in the case of new year's China diagnosis of breast cancer cases and deaths accounted for 12.2% of global 9.6%[1], this figure continues to rise, speeding up our in-depth research on breast cancer.Berns[2] and SUN Y[3] et al have demonstrated that RSK4 (P90 ribosomal protein S6 kinase 4, P90 Ribosomal S6 kinase 4) is an important factor to inhibit the invasion and metastasis of breast cancer, it can inhibit the growth of breast cancer cells and induce senescence, but the effect by mRNA splicing variants of RSK4 into the downlink (RSK4 variants RSK4m) we don't know much about it. Due to the lack of RSK4 exon nineteenth mutation occurred in 15 (-15nt) deletion and exon twenty-first mutation (-E21), the free combination of the formation of three body bottom second lack of variation Exons, namely +15nt-E21 (variant 1); the lack of 15 bases before the nineteenth exon, namely -15nt+E21 (variant 2); the lack of the nineteenth exon 15 bases before and last second exons, namely -15nt-E21 (Variant 3). In this article we the newly discovered RSK4 variants, their research is still in its infancy, especially with the wild type RSK4 functional differences, is the same or opposite, we do not understand, if you lose the inhibition function, whether it can be used as new targeted marker, if can force the same restraint, that is the same mechanism to cause or have different mechanisms, which are more likely to affect regulation of tumor cell invasion and metastasis. The purpose of this study is to search for proteins interacting with RSK4m, so as to further research the molecular mechanism and function in breast cancer. 2. Research methods: were constructed with two Strep- tag and a flag tag [4] (tandem affinity purification tag) RSK4 variant 2 (RSK4m2) and RSK4 (RSK4m3) variant 3 overexpression of lentivirus stably transfected into MDA-MB-231 cells, using Western blot (Western Blot) and real time fluorescence quantitative PCR (Real-time fluorogenic quantitatice PCR) to detect the expression of protein and mRNA variants, were identified by tandem affinity purification of protein, and then find out the interaction protein through the bioinformatics analysis, and then by CO immunoprecipitation (Co-Immunoprecipitation, CO-IP) to verify the interaction between [5]. selected from the results of heat shock protein HSP90aa1 and RSK4m2 finally detected by CCK-8 after transfection of MDA-MB-231 breast cancer cells growth and proliferation of [6]. findings: this research by Tandem affinity purification of two Strep II tag and a FLAG tag based (SF-TAP) combined with nano LC-MS/MS mass spectrometry were isolated and identified 452 proteins associated with RSK4m2, 713 RSK4m3 related protein.GO analysis results: the interaction of many physiological activities of protein involved in cell RSK4m2 or RSK4m3, IPA results: RSK4m2 and RSK4m3 accumulation in the highest degree of protein interaction networks, including RSK4m2 and HSP90aa1 there is a direct interaction. The results show that two kinds of variants involved in various cellular activities, and has a variety of biological functions. At the same time, CO-IP confirmed that HSP90aa1 interacted with RSK4m2.CCK-8 results over expression of RSK4m2 group. The expression inhibition rate of RSK4m3 group in 24,48,72,96h cells (%) respectively, 3.9 + 0.01,5.6 + 0.01,31.1 + 0.01,23.6 + 0.02; 1.5 + 0,4.4 + 0.03,22.1 + 0.05, 19.7+0.02, with statistically significant differences in 48,72,96h (P0.05). Conclusion: RSK4m2 and RSK4m3 can be stronger inhibition of breast cancer cell line MDA-MB-231 proliferation, the results showed that RSK4m could inhibit the proliferation of breast cancer cells, but may be related to the wild type RSK4 (RSK4w) has a different mechanism, RSK4m may have more the biological function of RSK4w, RSKm2 may be through inhibition of HSP90aa1 to prevent the growth of cancer cells, but the specific function which needs to be more in-depth research.

【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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