發(fā)布時(shí)間：2018-01-07 07:18

  本文關(guān)鍵詞：對(duì)急性髓系白血病患者及HL-60細(xì)胞株中白血病干細(xì)胞的研究　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：[目的]研究急性髓系白血病(AML)患者中白血病干細(xì)胞(Leukemia stem cell, LSC)的表達(dá)情況,以及三氧化二砷(As2O3)對(duì)HL-60細(xì)胞株中干細(xì)胞的作用,探討白血病干細(xì)胞與疾病的預(yù)后關(guān)系,尋找干預(yù)白血病干細(xì)胞的治療的新思路。[方法]免疫磁珠分選法分選AML患者骨髓中單個(gè)核細(xì)胞CD34+、 CD34+/CD123+細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)分選前、后陽性細(xì)胞的表達(dá)率,結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。免疫磁珠分選法分選HL-60細(xì)胞株中CD34+ CD34+/CD123+細(xì)胞群,設(shè)置不同濃度As2O3對(duì)分選后CD34+細(xì)胞群作用24h、48h和72h,采用改良MTS法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用；Annexin V-FITC/PI雙染法及PI單染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)As2O3對(duì)CD34+細(xì)胞群細(xì)胞周期及凋亡、壞死的影響；MS-PCR法檢測(cè)CD34+細(xì)胞群ID4、CDH13、SFRP2基因甲基化情況,觀察A8203的去甲基化作用。[結(jié)果]1.20名AML患者中普遍表達(dá)CD34+、CD34+/CD123+,未分選前CD34+的表達(dá)率為32.92±30.16%,CD34+/CD123+的表達(dá)率為10.70±12.13%,采用免疫磁珠標(biāo)記分選后CD34+的表達(dá)率為74.87±10.49%,CD34+/CD123+的表達(dá)率為68.29±12.99%；分選后CD34+的表達(dá)率、CD34+/CD123+的表達(dá)率均比分選前高(P0.05),磁珠分選后陽性細(xì)胞富集效果明顯,可得到純度較高的細(xì)胞群。CD34+的得率為21.77±8.27%,CD34+/CD123+的得率為16.35±3.52%。磁珠分選法所得細(xì)胞數(shù)量較少,對(duì)后續(xù)研究造成困難。2.CD34+抗原的表達(dá)率,初治組為28.63+25.44%,難治復(fù)發(fā)組為67.72±22.04%,完全緩解組為4.74±7.64%；CD34+/CD123+抗原的表達(dá)率,初治組為10.84±9.51%,難治復(fù)發(fā)組為23.41±10.01%,完全緩解組為2.91±6.25%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,CD34+抗原的表達(dá)率,難治復(fù)發(fā)組高于初治組和完全緩解,初治組高于完全緩解組、低于難治復(fù)發(fā)組,兩兩對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；CD34+/CD123+的表達(dá)率,難治復(fù)發(fā)組高于完全緩解組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),初治組與完全緩解組、難治復(fù)發(fā)組間對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.HL-60細(xì)胞株中分選前CD34+的表達(dá)率為4.06±2.11%,CD34+/CD123+的表達(dá)率為1.65±0.79%；分選后CD34+的表達(dá)率為72.8±12.58%,CD34+/CD123+的表達(dá)率為12.67±0.071%；分選后陽性細(xì)胞經(jīng)條件培養(yǎng)1周后CD34+的表達(dá)率為80.71±5.43%,CD34+/CD123+的表達(dá)率為11.04±1.25%。分選后、培養(yǎng)1周的細(xì)胞比分選前CD34+的表達(dá)率高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；分選前、后及培養(yǎng)1周后CD34+/CD123+的表達(dá)率低,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.用不同濃度的A8203干預(yù)HL-60細(xì)胞株以及分選后CD34+細(xì)胞群24h、48h、72h后,有明顯的增殖抑制作用,以72h12umol/1最顯著,具有時(shí)效和量效關(guān)系。5.HL-60細(xì)胞株中CD34+細(xì)胞群大部分處于G0/G1期(87.7%),低濃度的AS2O3可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞株中CD34+細(xì)胞群進(jìn)入細(xì)胞周期(S期為主),2umol/172時(shí)處于S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)量最多(51.4±2.80%),隨著濃度的提高,G0/G1期逐漸增多,S期細(xì)胞先增加、后減少,G2/M期無明顯規(guī)律。當(dāng)72h 12umol/1時(shí),As2O3主要以阻滯細(xì)胞處于GO/G1期為主(84.21±3.42%)。6.As2O3對(duì)HL-60細(xì)胞株分選后的CD34+細(xì)胞群有促進(jìn)凋亡和壞死的作用,以72h12umol/1最甚,作用呈現(xiàn)明顯的時(shí)效和量效依賴的關(guān)系。As203作用于HL-60細(xì)胞株分選后的CD34+細(xì)胞群,無論作用時(shí)間長(zhǎng)短及藥物濃度高低,細(xì)胞均以凋亡為主。7.用MS-PCR法檢測(cè)HL-60細(xì)胞株中ID4、CDH13、SFRP2基因甲基化情況,ID4基因可以擴(kuò)增出甲基化和非甲基化條帶,判定為甲基化陽性；CDH13基因可以擴(kuò)增出甲基化條帶,判定為甲基化陽性；SFRP2基因可以擴(kuò)增出甲基化條帶和非甲基化條帶,判定為甲基化陽性。不同濃度As2O3對(duì)HL-60細(xì)胞株中CD34+細(xì)胞群作用72h后,ID4、CDH13基因仍然存在甲基化。[結(jié)論]1.20例AML患者的骨髓標(biāo)本普遍表達(dá)CD34+、CD34+/CD123+,表達(dá)率從低到高不等。CD34+/CD123+表達(dá)率在難治復(fù)發(fā)組高于完全緩解組,在一定程度上可以反映病情的進(jìn)展,高表達(dá)提示預(yù)后不良,并且可以據(jù)此用來評(píng)估LSC的數(shù)量及增殖情況。經(jīng)過磁珠分選后CD34+、CD34+/CD123+的表達(dá)率明顯提高。免疫磁珠分選法耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便,對(duì)細(xì)胞損傷不大,是獲得白血病患者骨髓中含量稀少的白血病干細(xì)胞的有效方法。2.HL-60細(xì)胞株中存在CD34+、CD34+/CD123+細(xì)胞群,所占比例均較低；采用免疫磁珠標(biāo)記分選后CD34+的表達(dá)率明顯提高,CD34+/CD123+的表達(dá)率仍較低。分選后與培養(yǎng)1周后的CD34+細(xì)胞表達(dá)率對(duì)比無明顯差異,該群細(xì)胞的特性相對(duì)穩(wěn)定。As2O3對(duì)HL-60細(xì)胞株中CD34+細(xì)胞群有抑制增殖和促進(jìn)凋亡、壞死的作用,呈明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。HL-60細(xì)胞株中CD34+細(xì)胞群大多數(shù)處于G0/G1期,低濃度的As2O3能誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞群進(jìn)入細(xì)胞周期(S期為主)；高濃度的As2O3能阻滯CD34+細(xì)胞群于G0/G1期。3.HL-60細(xì)胞株中CD34+細(xì)胞群ID4基因、SFRP2基因和CDH13的甲基化陽性。As2O3對(duì)HL-60細(xì)胞株中CD34+細(xì)胞群去甲基化作用不明顯。
[Abstract]:[鐩殑]鐮旂┒鎬ユ，

本文編號(hào)：1391530