本文關(guān)鍵詞：載脂蛋白E影響巨噬細胞因子表達及分型的機制研究　出處：《河北醫(yī)科大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:巨噬細胞作為固有免疫的第一道屏障,能通過誘導T細胞募集和活化來促進適應性免疫,對外來病原體的防御、清除和直接殺傷腫瘤細胞并提呈腫瘤相關(guān)抗原起著至關(guān)重要的作用。在不同細胞因子構(gòu)成的微環(huán)境影響下,巨噬細胞分化為不同的功能表型。M1型巨噬細胞具有殺滅細菌和腫瘤細胞的能力;M2型巨噬細胞則具有組織修復和促進腫瘤細胞增殖、侵襲及抑制T細胞與自然殺傷細胞免疫活性等能力。M1型和M2型巨噬細胞數(shù)量上是一種動態(tài)平衡,若失衡則會導致病理性疾病的發(fā)生。因此,隨著探討極化巨噬細胞抑制和促進腫瘤進展的雙重作用機制的不斷深入,本課題為將來的基因治療提供重要的實驗依據(jù)。載脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)是一種分子量為35k Da的糖蛋白,其m RNA廣泛表達于肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、皮膚、腦和各種細胞(如巨噬細胞、卵巢顆粒細胞),主要功能是調(diào)節(jié)血漿蛋白、脂蛋白的運輸及代謝過程。大量文獻提示,Apo E參與腫瘤的發(fā)展過程,與肝細胞株相比,肝癌細胞株Hep G2中Apo E蛋白水平顯著增加,但Apo E在卵巢癌細胞中的表達增加卻預示預后良好。這些結(jié)果表明,Apo E在人類腫瘤中的作用并不一致,究竟是什么原因?qū)е翧po E的作用有如此大的不同?腫瘤細胞分泌的前列腺素E2(PGE2)是腫瘤微環(huán)境中一種重要的因子,其抑制活化巨噬細胞中CCL5 m RNA和蛋白的表達。炎癥和炎性介質(zhì)是腫瘤微環(huán)境的重要貢獻者。為此,本研究利用LPS和PGE2模擬腫瘤微環(huán)境,以小鼠巨噬細胞株RAW264.7為模型,通過建立高表達Apo E的RAW264.7細胞株,研究Apo E在腫瘤微環(huán)境下對RAW264.7細胞細胞因子分泌、功能表型分化的影響,以期為腫瘤免疫治療提供新的理論視角。方法:1應用Lipofectamine 2000瞬時轉(zhuǎn)染Apo E,建立高表達Apo E細胞株,SYBR Green熒光染料法實時定量PCR檢測Apo E的表達。2實時定量PCR檢測瞬時轉(zhuǎn)染Apo E的RAW264.7細胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和i NOS m RNA表達;利用流式細胞儀檢測巨噬細胞表面標志分子CD86和CD206表達情況。3 Western blot檢測與炎癥、增殖等MAPK相關(guān)蛋白(P-p38、P-ERK 1/2)的表達。結(jié)果:1構(gòu)建了高表達Apo E的瞬時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞株,SYBR Green熒光染料法實時定量檢測Apo E的表達,結(jié)果顯示,與RAW264.7細胞株相比,Apo E表達水平增高5.1±0.4倍,具有統(tǒng)計學意義。2實時定量PCR檢測活化巨噬細胞炎性細胞因子表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,在RAW264.7細胞和高表達Apo E RAW264.7細胞株中,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA表達均增加,但高表達Apo E RAW264.7細胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6表達增高倍數(shù)明顯低于RAW264.7細胞,差異有統(tǒng)計學意義。3實時定量PCR檢測PGE2刺激后巨噬細胞炎性細胞因子的表達,結(jié)果顯示,與RAW264.7細胞相比,高表達Apo E RAW264.7細胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10表達降低,差異有統(tǒng)計學意義。4實時定量PCR檢測PGE2刺激活化巨噬細胞炎性細胞因子的表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,在RAW264.7細胞和高表達Apo E RAW264.7細胞株中,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA表達明顯增加,但高表達Apo E RAW264.7細胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10表達增加倍數(shù)明顯低于RAW264.7細胞,差異有統(tǒng)計學意義。5實時定量PCR檢測Apo E m RNA表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,LPS刺激巨噬細胞后Apo E m RNA表達降低,而PGE2則促進LPS刺激活化的巨噬細胞中Apo E m RNA表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義。6實時定量PCR檢測i NOS m RNA表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,在野生型小鼠BMDMs細胞中,LPS刺激細胞后,i NOS m RNA表達增高,而在Apo E基因敲除小鼠BMDMs細胞中,LPS刺激后,i NOS m RNA表達則降低;PGE2刺激活化巨噬細胞后,野生型和Apo E基因敲除型小鼠BMDMs細胞中i NOS m RNA表達均增高,但Apo E基因敲除型小鼠BM-DMs細胞i NOS表達增高的倍數(shù)高于野生型小鼠BMDMs,差異有統(tǒng)計學意義。7利用流式細胞技術(shù)檢測BMDMs細胞表面CD86和CD206分子表達情況,結(jié)果顯示,在野生小鼠BMDMs細胞中,與對照組相比,LPS刺激巨噬細胞后,CD86和CD206均升高,而LPS和PGE2同時刺激細胞時,CD86和CD206分子表達均降低;而在Apo E基因敲除小鼠BMDMs細胞中,LPS刺激后,CD86分子升高,而CD206分子降低,LPS和PGE2同時刺激細胞時,則CD86和CD206分子表達均降低,且降低程度低于野生組,差異有統(tǒng)計學意義。8 Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,野生型小鼠和Apo E基因敲除型小鼠BMDMs細胞在LPS刺激下,P-p38、P-ERK1/2增加;PGE2刺激則P-p38、P-ERK1/2降低;LPS和PGE2共同刺激時,P-p38增加,P-ERK1/2降低,但Apo E基因敲除型小鼠BMDMs p38、ERK1/2磷酸化程度明顯高于野生型小鼠,差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論:1 Apo E在PGE2刺激活化巨噬細胞中抑制IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA的表達。2 PGE2促進活化巨噬細胞中Apo E m RNA表達。3 Apo E在PGE2刺激活化巨噬細胞中抑制i NOS m RNA的表達,抑制細胞向M1型巨噬細胞分化。4 Apo E在PGE2刺激活化巨噬細胞中抑制CD86分子表達,促進CD206分子表達,即促進巨噬細胞向M2型細胞分化。5 PGE2刺激活化巨噬細胞使Apo E表達增加是通過p38和ERK1/2信號轉(zhuǎn)導途徑實現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.3

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本文編號：1355305