發(fā)布時(shí)間：2017-12-30 14:18

  本文關(guān)鍵詞：載脂蛋白E影響巨噬細(xì)胞因子表達(dá)及分型的機(jī)制研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:巨噬細(xì)胞作為固有免疫的第一道屏障,能通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞募集和活化來(lái)促進(jìn)適應(yīng)性免疫,對(duì)外來(lái)病原體的防御、清除和直接殺傷腫瘤細(xì)胞并提呈腫瘤相關(guān)抗原起著至關(guān)重要的作用。在不同細(xì)胞因子構(gòu)成的微環(huán)境影響下,巨噬細(xì)胞分化為不同的功能表型。M1型巨噬細(xì)胞具有殺滅細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的能力;M2型巨噬細(xì)胞則具有組織修復(fù)和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及抑制T細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞免疫活性等能力。M1型和M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量上是一種動(dòng)態(tài)平衡,若失衡則會(huì)導(dǎo)致病理性疾病的發(fā)生。因此,隨著探討極化巨噬細(xì)胞抑制和促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的雙重作用機(jī)制的不斷深入,本課題為將來(lái)的基因治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。載脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)是一種分子量為35k Da的糖蛋白,其m RNA廣泛表達(dá)于肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、皮膚、腦和各種細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、卵巢顆粒細(xì)胞),主要功能是調(diào)節(jié)血漿蛋白、脂蛋白的運(yùn)輸及代謝過(guò)程。大量文獻(xiàn)提示,Apo E參與腫瘤的發(fā)展過(guò)程,與肝細(xì)胞株相比,肝癌細(xì)胞株Hep G2中Apo E蛋白水平顯著增加,但Apo E在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)增加卻預(yù)示預(yù)后良好。這些結(jié)果表明,Apo E在人類腫瘤中的作用并不一致,究竟是什么原因?qū)е翧po E的作用有如此大的不同?腫瘤細(xì)胞分泌的前列腺素E2(PGE2)是腫瘤微環(huán)境中一種重要的因子,其抑制活化巨噬細(xì)胞中CCL5 m RNA和蛋白的表達(dá)。炎癥和炎性介質(zhì)是腫瘤微環(huán)境的重要貢獻(xiàn)者。為此,本研究利用LPS和PGE2模擬腫瘤微環(huán)境,以小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7為模型,通過(guò)建立高表達(dá)Apo E的RAW264.7細(xì)胞株,研究Apo E在腫瘤微環(huán)境下對(duì)RAW264.7細(xì)胞細(xì)胞因子分泌、功能表型分化的影響,以期為腫瘤免疫治療提供新的理論視角。方法:1應(yīng)用Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Apo E,建立高表達(dá)Apo E細(xì)胞株,SYBR Green熒光染料法實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Apo E的表達(dá)。2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Apo E的RAW264.7細(xì)胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和i NOS m RNA表達(dá);利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志分子CD86和CD206表達(dá)情況。3 Western blot檢測(cè)與炎癥、增殖等MAPK相關(guān)蛋白(P-p38、P-ERK 1/2)的表達(dá)。結(jié)果:1構(gòu)建了高表達(dá)Apo E的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞株,SYBR Green熒光染料法實(shí)時(shí)定量檢測(cè)Apo E的表達(dá),結(jié)果顯示,與RAW264.7細(xì)胞株相比,Apo E表達(dá)水平增高5.1±0.4倍,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)活化巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在RAW264.7細(xì)胞和高表達(dá)Apo E RAW264.7細(xì)胞株中,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA表達(dá)均增加,但高表達(dá)Apo E RAW264.7細(xì)胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)增高倍數(shù)明顯低于RAW264.7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PGE2刺激后巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的表達(dá),結(jié)果顯示,與RAW264.7細(xì)胞相比,高表達(dá)Apo E RAW264.7細(xì)胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PGE2刺激活化巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在RAW264.7細(xì)胞和高表達(dá)Apo E RAW264.7細(xì)胞株中,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA表達(dá)明顯增加,但高表達(dá)Apo E RAW264.7細(xì)胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10表達(dá)增加倍數(shù)明顯低于RAW264.7細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Apo E m RNA表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,LPS刺激巨噬細(xì)胞后Apo E m RNA表達(dá)降低,而PGE2則促進(jìn)LPS刺激活化的巨噬細(xì)胞中Apo E m RNA表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)i NOS m RNA表達(dá),結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在野生型小鼠BMDMs細(xì)胞中,LPS刺激細(xì)胞后,i NOS m RNA表達(dá)增高,而在Apo E基因敲除小鼠BMDMs細(xì)胞中,LPS刺激后,i NOS m RNA表達(dá)則降低;PGE2刺激活化巨噬細(xì)胞后,野生型和Apo E基因敲除型小鼠BMDMs細(xì)胞中i NOS m RNA表達(dá)均增高,但Apo E基因敲除型小鼠BM-DMs細(xì)胞i NOS表達(dá)增高的倍數(shù)高于野生型小鼠BMDMs,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BMDMs細(xì)胞表面CD86和CD206分子表達(dá)情況,結(jié)果顯示,在野生小鼠BMDMs細(xì)胞中,與對(duì)照組相比,LPS刺激巨噬細(xì)胞后,CD86和CD206均升高,而LPS和PGE2同時(shí)刺激細(xì)胞時(shí),CD86和CD206分子表達(dá)均降低;而在Apo E基因敲除小鼠BMDMs細(xì)胞中,LPS刺激后,CD86分子升高,而CD206分子降低,LPS和PGE2同時(shí)刺激細(xì)胞時(shí),則CD86和CD206分子表達(dá)均降低,且降低程度低于野生組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8 Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,野生型小鼠和Apo E基因敲除型小鼠BMDMs細(xì)胞在LPS刺激下,P-p38、P-ERK1/2增加;PGE2刺激則P-p38、P-ERK1/2降低;LPS和PGE2共同刺激時(shí),P-p38增加,P-ERK1/2降低,但Apo E基因敲除型小鼠BMDMs p38、ERK1/2磷酸化程度明顯高于野生型小鼠,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:1 Apo E在PGE2刺激活化巨噬細(xì)胞中抑制IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA的表達(dá)。2 PGE2促進(jìn)活化巨噬細(xì)胞中Apo E m RNA表達(dá)。3 Apo E在PGE2刺激活化巨噬細(xì)胞中抑制i NOS m RNA的表達(dá),抑制細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞分化。4 Apo E在PGE2刺激活化巨噬細(xì)胞中抑制CD86分子表達(dá),促進(jìn)CD206分子表達(dá),即促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型細(xì)胞分化。5 PGE2刺激活化巨噬細(xì)胞使Apo E表達(dá)增加是通過(guò)p38和ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.3

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