本文關(guān)鍵詞：造血調(diào)控分子PPP2Cβ參與紅系分化及EDAG在白血病發(fā)生中的作用研究　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：紅細(xì)胞的生成受到多層次、多水平的調(diào)控,其中轉(zhuǎn)錄因子在紅細(xì)胞生成過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。GATA1是目前研究最為深入的紅系轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。GATA1一方面可通過翻譯后水平修飾如乙�；�、磷酸化等,進(jìn)而調(diào)控其自身轉(zhuǎn)錄活性,另一方面還可與其它多種轉(zhuǎn)錄因子形成動(dòng)態(tài)復(fù)合體,對(duì)下游基因進(jìn)行選擇性調(diào)控,進(jìn)而參與紅系分化。本研究主要圍繞GATA1的兩個(gè)相互作用蛋白PPP2C?與EDAG展開研究,揭示了PPP2C?與GATA1相互作用并調(diào)控紅系分化的新功能,并探討了EDAG在BCR-ABL及MLL-AF9誘導(dǎo)的白血病中的作用。本研究分為以下兩部分:第一部分:PPP2C?與GATA1相互作用促進(jìn)紅系分化的研究我們實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交構(gòu)建了造血干細(xì)胞(HSC)轉(zhuǎn)錄因子相互作用網(wǎng)絡(luò),在該網(wǎng)絡(luò)中,蛋白磷酸酶2A的催化亞基β(PPP2Cβ)是GATA1新的相互作用蛋白,提示PPP2Cβ很可能調(diào)控造血分化。本部分我們首先利用促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)誘導(dǎo)臍血CD34+細(xì)胞向紅系分化,檢測(cè)了PPP2Cβ在分化過程中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在m RNA水平還是蛋白水平PPP2Cβ都發(fā)生明顯上調(diào),而在分化晚期恢復(fù)正常水平,表明PPP2Cβ很可能在紅系早期分化過程中發(fā)揮重要功能。進(jìn)一步我們構(gòu)建了PPP2Cβ帶Flag標(biāo)簽的表達(dá)載體,利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)GATA1和PPP2Cβ存在相互作用,并確定了PPP2Cβ結(jié)合在GATA1的N端鋅指結(jié)構(gòu)。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證明,PPP2Cβ能增強(qiáng)GATA1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性且能促進(jìn)GATA1下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。進(jìn)一步利用慢病毒表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建過表達(dá)PPP2Cβ的K562細(xì)胞穩(wěn)定株,發(fā)現(xiàn)PPP2Cβ過表達(dá)可促使K562細(xì)胞自發(fā)向紅系分化。這些結(jié)果表明PPP2Cβ可調(diào)控GATA1活性,是一種新的紅系分化調(diào)控分子。第二部分:EDAG在白血病發(fā)生中的作用研究紅系分化相關(guān)基因(Erythroid Differentiation Associated Gene,EDAG)是我們實(shí)驗(yàn)室率先分離克隆的新基因,特異表達(dá)于造血組織,參與調(diào)控造血細(xì)胞的增殖、分化與HSC的譜系分化平衡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)EDAG可與GATA1相互作用,通過募集p300增強(qiáng)GATA1乙酰化水平及轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性,三者形成動(dòng)態(tài)復(fù)合體,選擇性激活紅系分化相關(guān)基因,進(jìn)而促進(jìn)紅系分化。同時(shí),我們也發(fā)現(xiàn)EDAG除了促進(jìn)紅系分化外,還可能與白血病的發(fā)生有關(guān)。本部分我們探討了EDAG在BCR-ABL誘發(fā)的CML(慢性髓系白血病)及MLL-AF9誘發(fā)的AML(急性粒細(xì)胞白血病)發(fā)生中的作用。我們首先對(duì)BCR-ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行了包裝,獲得高滴度病毒,并制備了BCR-ABL誘發(fā)的CML小鼠模型。對(duì)BCR-ABL感染的臍血CD34+細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EDAG表達(dá)顯著上調(diào)。進(jìn)一步將BCR-ABL病毒感染EDAG基因敲除小鼠和正常小鼠的骨髓細(xì)胞,進(jìn)行骨髓移植。結(jié)果顯示敲低EDAG可降低BCR-ABL誘發(fā)的CML發(fā)病率,表現(xiàn)為移植EDAG敲除小鼠骨髓細(xì)胞的受體小鼠發(fā)病時(shí)間明顯晚于對(duì)照小鼠,外周血白細(xì)胞數(shù)目顯著低于對(duì)照組,這些結(jié)果表明EDAG在BCR-ABL誘發(fā)的CML發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。此外,我們利用MLL-AF9轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)價(jià)了EDAG敲除在AML細(xì)胞浸潤(rùn)中的作用。在發(fā)病的MLL-AF9小鼠骨髓及脾臟中,EDAG表達(dá)顯著降低。進(jìn)一步將發(fā)病的MLL-AF9轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞移植到EDAG基因敲除小鼠和野生型小鼠體內(nèi),研究造血微環(huán)境對(duì)白血病細(xì)胞的影響,結(jié)果表明兩組小鼠在血象各項(xiàng)指標(biāo)中和外周血的譜系中并沒有明顯區(qū)別,且存活率沒有差異。綜上所述,我們揭示了PPP2Cβ是紅系分化過程中一個(gè)新的調(diào)控因子;并發(fā)現(xiàn)EDAG在BCR-ABL逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)的CML中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:The formation of red blood cells is regulated by multilevel and multilevel, and the transcription factors play an important role in the process of erythrocyte formation. GATA1 is the most deeply researched transcription factor in red system. On the one hand, GATA1 can regulate its transcriptional activity through translational horizontal modifications such as acetylation and phosphorylation. On the other hand, it can also form dynamic complexes with other transcription factors, selectively regulate downstream genes and participate in erythroid differentiation. In this study, we focused on the two interacting proteins of GATA1, PPP2C and EDAG, revealing the interaction between PPP2C and GATA1, and regulating the new functions of erythroid differentiation. We also discussed the role of EDAG in BCR-ABL and MLL-AF9 induced leukemia. This study is divided into two parts: the first part: PPP2C? And GATA1 interaction on promoting erythroid differentiation ourprevious using yeast two hybrid constructs of hematopoietic stem cells (HSC) transcription factor interaction network, in the network, protein phosphatase 2A catalytic subunit beta (PPP2C beta) is GATA1 the role of new proteins, suggesting that PPP2C might regulate hematopoietic differentiation of beta. In this part, we first use of erythropoietin (Erythropoietin, EPO) induced differentiation of umbilical cord blood red cell line CD34+, detect the expression of PPP2C beta in the differentiation process, it is found that significantly increase occurred in M RNA and protein levels of PPP2C beta, and returned to normal level in the late stage of differentiation, is likely to show that PPP2C beta play an important role in early erythroid differentiation. Further, we constructed the expression vector of PPP2C beta with Flag tag. The interaction between GATA1 and PPP2C beta was confirmed by CO immunoprecipitation assay, and the zinc finger structure at the N end of GATA1 was confirmed. The double luciferase reporter gene experiment showed that PPP2C beta could enhance the transcriptional regulation activity of GATA1 and promote the transcription of target gene in the downstream of GATA1. Further using lentiviral expression system, construct the over expression of PPP2C beta K562 cells showed that PPP2C overexpression, beta K562 cells can promote spontaneous erythroid differentiation. These results indicate that PPP2C beta can regulate the activity of GATA1 and is a new regulation molecule of red system differentiation. The second part: the role of erythroid differentiation related gene EDAG in the pathogenesis of leukemia (Erythroid Differentiation Associated Gene, EDAG) was first isolated in our laboratory, gene cloning, specific expression in hematopoietic tissue, involved in the regulation of hematopoietic cell proliferation, differentiation and HSC lineage differentiation balance. Our previous studies found that EDAG could interact with GATA1, enhance the level of GATA1 acetylation and transcriptional regulatory activity through recruitment of P300, and the three form dynamic complexes, which selectively activate erythroid differentiation related genes, and then promote erythroid differentiation. At the same time, we also found that EDAG may be associated with the development of leukaemia in addition to the promotion of red lineage differentiation. In this section, we explored the role of EDAG in the pathogenesis of BCR-ABL induced CML (chronic myeloid leukemia) and MLL-AF9 induced AML (acute myelocytic leukemia). We first packed the BCR-ABL retrovirus, obtained a high titer virus, and prepared a BCR-ABL induced CML mouse model. The detection of CD34+ cells from BCR-ABL infected umbilical cord blood found that the expression of EDAG was significantly up-regulated. The BCR-ABL virus was further infected with the EDAG gene knockout mice and the normal mice bone marrow cells, and the bone marrow transplantation was carried out. Results showed that knockdown of EDAG can reduce the incidence rate of CML induced by BCR-ABL, to transplant EDAG knockout onset time of recipient mice bone marrow cells of mice significantly later than control mice, peripheral white blood cell number was significantly lower than the control group, these results suggest that EDAG play an important role in the pathogenesis of BCR-ABL induced by CML process. In addition, we used MLL-AF9 transgenic mice to evaluate the role of EDAG knockout in the infiltration of AML cells. In the bone marrow and spleen of the MLL-AF9 mice, the expression of EDAG decreased significantly. The transplanted spleen cells of MLL-AF9 transgenic mice of EDAG gene knockout mice and the onset of wild type mice, effects of hematopoietic microenvironment of leukemia cells, the results showed that the two groups of mice on blood indicators and peripheral blood lineages were not significantly different, and the survival rate was no difference. In conclusion, we have revealed that PPP2C beta is a new regulatory factor in the process of erythroid differentiation, and it is found that EDAG plays an important role in BCR-ABL retroviral induced CML.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R733.7

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本文編號(hào)：1342208