本文關(guān)鍵詞：Notch信號對巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控機(jī)制及其在腫瘤進(jìn)展中作用的研究　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素作用下局部組織細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控,導(dǎo)致異常增殖而形成的新生物,可以發(fā)生于人體的大多數(shù)組織器官。傳統(tǒng)的治療手段包括外科手術(shù)、化療、放療等,雖然可能在很大程度上抑制了腫瘤的生長,但卻仍有明顯的缺陷:一方面,這些方法尚難以保證能將機(jī)體內(nèi)所有的腫瘤細(xì)胞清除殆盡,故腫瘤復(fù)發(fā)成為了臨床上棘手的問題;另一方面,患者在反復(fù)治療的過程中產(chǎn)生的耐藥問題嚴(yán)重影響了常規(guī)治療的效果。因此,如何更好的闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,從而尋找更有效的腫瘤治療的靶點(diǎn)一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)問題。巨噬細(xì)胞作為經(jīng)典的天然免疫細(xì)胞,存在于機(jī)體的所有組織當(dāng)中,在機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持、病原體防御以及組織損傷修復(fù)等許多生理病理過程起到了至關(guān)重要的作用。它具有很強(qiáng)的可塑性和顯著的功能多樣性。巨噬細(xì)胞依據(jù)功能狀態(tài)的不同可分為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1型巨噬細(xì)胞)與替代活化型巨噬細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)。M1型巨噬細(xì)胞可以通過Th1細(xì)胞應(yīng)答促進(jìn)炎癥、殺傷腫瘤細(xì)胞,但是其產(chǎn)生的炎性因子IL-6、TNF-α可通過JAK/STAT3和NF-κB等信號途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖而促進(jìn)腫瘤生長。M2型巨噬細(xì)胞通過Th2細(xì)胞應(yīng)答發(fā)揮對抗炎癥、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)作用,還可通過分泌EGF、VEGF等影響細(xì)胞增殖、促進(jìn)新生血管形成,從而影響腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。巨噬細(xì)胞除了依據(jù)功能狀態(tài)的不同而發(fā)揮不同作用以外,還可能由于其來源的不同在腫瘤中發(fā)揮不同的調(diào)控作用。最新的研究表明機(jī)體絕大多數(shù)的組織定居巨噬細(xì)胞都是來自于卵黃囊/胚胎時期的造血干細(xì)胞,而非人們傳統(tǒng)觀念中所認(rèn)為的成體骨髓單核細(xì)胞,并且這些組織定居巨噬細(xì)胞可以完全依賴自我增殖來更新。目前,組織定居巨噬細(xì)胞和成體骨髓單核細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞對各類疾病的貢獻(xiàn)及調(diào)控機(jī)制是巨噬細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。特別的,在腫瘤中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor Associated Macrophags,TAMs)的來源、分化調(diào)控機(jī)制尚不清楚。TAMs存在于所有實體腫瘤中,是浸潤腫瘤的主要免疫細(xì)胞亞群之一。近年來,大量的研究證實巨噬細(xì)胞以多種方式參與了在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可以基于激活模式的不同(M1型和M2型巨噬細(xì)胞)而對腫瘤產(chǎn)生不同效應(yīng),并且影響腫瘤組織的各個方面,包括干細(xì)胞、血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移等。臨床研究顯示多數(shù)的人類腫瘤中TAMs的增多與患者較差的預(yù)后密切相關(guān)。反之,腫瘤細(xì)胞又可以通過多種方式影響腫瘤微環(huán)境,從而改變巨噬細(xì)胞的表型,促使TAMs向免疫抑制型轉(zhuǎn)變,促進(jìn)腫瘤自身生長。由于巨噬細(xì)胞具有較強(qiáng)的可塑性,TAMs對于腫瘤生長發(fā)揮促進(jìn)還是抑制作用尚有爭議。盡管如此,利用巨噬細(xì)胞的可塑性,操控巨噬細(xì)胞的激活模式去除有害效應(yīng)、放大有利效應(yīng),從而達(dá)到治療惡性腫瘤如肝癌、肺癌的干預(yù)理念與措施,已經(jīng)引起研究人員的廣泛關(guān)注。但是目前腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化以及功能的精確調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚,在很大程度上制約了新的治療技術(shù)與方法的發(fā)展,因而深入理解調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分子機(jī)制是有效進(jìn)行腫瘤免疫學(xué)治療的前提。Notch信號是一條調(diào)控細(xì)胞分化與發(fā)育高度保守的信號通路。當(dāng)相鄰細(xì)胞的Notch受體、配體相互接觸時,γ-分泌酶(γ-secretase)催化裂解形成Notch胞內(nèi)段(Notch intracellular domain,NIC)。之后NIC進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合并激活轉(zhuǎn)錄因子RBP-Jk(recombination signal-binding protein Jk),調(diào)控分化相關(guān)基因Hes和Hey分子的轉(zhuǎn)錄,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、發(fā)育、增殖、凋亡等過程。以往的研究發(fā)現(xiàn)Notch信號通路不僅在T、B淋巴細(xì)胞的分化上起決定性作用,而且在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞或DC分化的方向選擇中也具有重要意義。我們課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn):Notch信號通路可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)從而影響其在實體腫瘤中發(fā)揮的功能。然而,Notch信號通路在體內(nèi)是如何調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化及功能,以及對應(yīng)的分子機(jī)制都尚不清楚。由于皮下部位組織定居巨噬細(xì)胞可能相對較少,可以體現(xiàn)從骨髓動員的單核細(xì)胞對TAM的貢獻(xiàn),而肝臟組織定居巨噬細(xì)胞(即Kupffer細(xì)胞)非常豐富,占機(jī)體組織定居巨噬細(xì)胞的80%-90%,可以較好的反映組織定居巨噬細(xì)胞對TAM的貢獻(xiàn)。所以本課題研究利用巨噬細(xì)胞特異性Notch通路缺陷的Lyz2creRBPJ-/-小鼠(KO小鼠)及對照野生型小鼠(WT小鼠)構(gòu)建皮下接種的肺癌模型(TAMs主要來源于骨髓單核細(xì)胞)與肝臟原位接種的肝癌模型(TAMs可能由骨髓單核細(xì)胞或組織定居型Kupffer細(xì)胞貢獻(xiàn))兩種模型以闡述Notch信號通路對不同來源腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分化及功能的調(diào)控及其對腫瘤進(jìn)展的影響。主要研究結(jié)果如下:1.皮下肺癌模型(1)腫瘤表型:連續(xù)測量腫瘤大小觀察到KO鼠皮下肺癌的生長比WT鼠減慢,剝離腫瘤后,發(fā)現(xiàn)KO鼠皮下肺癌體積及重量都小于WT小鼠。(2)腫瘤組織病理學(xué)變化:石蠟切片HE染色以及對CD31的免疫熒光染色提示KO鼠肺癌組織內(nèi)血管樣結(jié)構(gòu)的密度明顯低于WT鼠,其病理學(xué)變化與KO鼠腫瘤減小的表型變化一致。(3)巨噬細(xì)胞表型:流式分析及免疫熒光染色提示KO小鼠肺癌組織內(nèi)TAMs顯著少于WT小鼠。(4)巨噬細(xì)胞功能表型:①q-PCR實驗顯示:與WT鼠相比,KO鼠肺癌組織內(nèi)M2型極化分子標(biāo)志IL-10、Ym-1、Arg-1的表達(dá)下調(diào),而M1型極化分子標(biāo)志IL-1β上調(diào)。ELISA實驗顯示KO鼠皮下肺癌模型血清中IL-10水平顯著低于WT鼠,進(jìn)一步證實q-PCR結(jié)果。②流式細(xì)胞術(shù)分析表明兩組腫瘤內(nèi)T、B淋巴細(xì)胞數(shù)目之間的比較無顯著差異。(5)TAMs減少的機(jī)制探討:①TAM分化狀況:流式分析結(jié)果顯示KO鼠腫瘤、脾臟、骨髓中F4/80intCD11bhi單核前體細(xì)胞中Ly6c+細(xì)胞比例高于WT小鼠,提示其向巨噬細(xì)胞的分化可能受阻。②TAM的增殖情況:以免疫熒光染色對F4/80與Ki67進(jìn)行共染,結(jié)果顯示KO小鼠肺癌組織中TAMs的增殖能力比WT鼠降低。KO小鼠腫瘤組織中巨噬細(xì)胞增殖相關(guān)因子CSF1、CSF2表達(dá)均下調(diào)。③TAM的趨化狀況:KO小鼠腫瘤組織中趨化因子CCL7、內(nèi)皮細(xì)胞受體VEGFR1表達(dá)均下調(diào)。2.原位肝癌模型(1)腫瘤表型:剝離小鼠肝癌包塊,發(fā)現(xiàn)KO鼠原位肝癌腫瘤體積及重量都大于WT小鼠。(2)腫瘤組織病理學(xué)變化:石蠟切片HE染色以及對CD31的免疫熒光染色提示KO小鼠原位肝癌組織內(nèi)血管樣結(jié)構(gòu)的密度明顯高于WT小鼠。(3)巨噬細(xì)胞表型:流式分析及免疫熒光染色提示KO小鼠原位肝癌組織內(nèi)TAMs顯著多于WT小鼠。(4)巨噬細(xì)胞功能表型:①q-PCR實驗顯示:與WT鼠相比,KO鼠肝癌組織內(nèi)M2型極化分子標(biāo)志IL10、Ym-1的表達(dá)上調(diào),而M1型極化分子標(biāo)志IL-1β下調(diào)。ELISA實驗顯示KO鼠原位肝癌模型血清中IL-10水平明顯高于WT鼠,與q-PCR結(jié)果一致。②流式分析表明KO小鼠肝癌組織中CD8+T細(xì)胞數(shù)目少于野生小鼠,癌旁組織中CD4+T細(xì)胞少于WT鼠,這與腫瘤增大的表型一致;KO小鼠血液CD4+T細(xì)胞多于WT鼠,提示可能是由于腫瘤增大導(dǎo)致外周參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞募集增多。(5)TAMs增多的機(jī)制探討:①TAM分化狀況:流式分析結(jié)果顯示KO小鼠肝癌組織中F4/80intCD11bhi單核前體細(xì)胞中Ly6c+細(xì)胞比例高于WT小鼠,與皮下LLC模型一致,提示其仍可能存在分化受阻,但癌旁組織、脾臟中并沒有見到同樣變化,骨髓中F4/80intCD11bhi細(xì)胞中Ly6c+細(xì)胞所占比例反而低于WT鼠。②TAM增殖狀況:對F4/80和Ki67的免疫熒光染色結(jié)果顯示KO小鼠肝癌組織中TAMs的增殖能力與WT鼠相比升高。但是KO小鼠腫瘤組織中巨噬細(xì)胞增殖相關(guān)因子CSF1表達(dá)下調(diào),CSF2無明顯差異,提示KO鼠原位肝癌TAMs增殖能力的上升可能是其他增殖相關(guān)因子變化導(dǎo)致的,比如IL-4等。③TAM的趨化狀況:KO小鼠腫瘤組織中趨化因子CCL9、內(nèi)皮細(xì)胞受體VEGFR1表達(dá)均上調(diào)。3.原位肝癌模型TAMs的來源由于皮下肺癌模型與原位肝癌模型的表型變化截然相反,我們推測原位肝癌模型中TAMs可能不同于皮下肺癌模型造成其受Notch信號調(diào)控的不同。我們構(gòu)建骨髓重建小鼠原位肝癌模型,結(jié)果顯示原位肝癌中TAMs只有約20%為GFP陽性,這提示著絕大多數(shù)TAMs并非來自于骨髓單核細(xì)胞,而可能是組織定居Kupffer細(xì)胞。通過以上實驗結(jié)果可以得到以下結(jié)論:1.小鼠皮下肺癌模型中特異性剔除巨噬細(xì)胞RBPJ抑制肺癌的進(jìn)展,而小鼠原位肝癌特異性剔除巨噬細(xì)胞RBPJ促進(jìn)肝癌的進(jìn)展,由此可知:特異性阻斷巨噬細(xì)胞Notch信號通路對不同部位接種腫瘤的生長影響不同。2.皮下肺癌模型TAMs可能主要來源于骨髓單核細(xì)胞,而單核細(xì)胞在Notch通路阻斷時,向TAMs分化受阻,導(dǎo)致TAMs減少。對應(yīng)的,腫瘤組織中M1型極化分子表達(dá)升高,M2型極化分子表達(dá)降低,新生血管形成減小,這些共同導(dǎo)致腫瘤減小;而MΦ增殖因子分泌減少導(dǎo)致TAMs增殖能力下降,可進(jìn)一步導(dǎo)致TAMs減少。而原位肝癌模型TAMs可能主要來自組織定居Kupffer細(xì)胞的原位增殖,而非骨髓單核細(xì)胞。雖然Notch通路阻斷可導(dǎo)致單核細(xì)胞分化受阻,但是Kupffer細(xì)胞的原位增殖不依賴于Notch通路而且在Notch阻斷的情況下增殖能力上升(依賴于M-CSF、GM-CSF以外的因子),最終導(dǎo)致TAMs增加。對應(yīng)的,腫瘤組織中M1型極化分子表達(dá)降低,M2型極化分子表達(dá)增加,新生血管形成增加,這些共同導(dǎo)致腫瘤增大。綜上,本研究工作詳細(xì)的闡明了皮下LLC腫瘤模型及原位肝癌模型中巨噬細(xì)胞Notch通路阻斷對于腫瘤組織病理學(xué)、免疫微環(huán)境以及巨噬細(xì)胞自身功能的影響,并且發(fā)現(xiàn)除了招募的骨髓單核細(xì)胞,組織定居型巨噬細(xì)胞也可以成為TAMs的來源,而且發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞向TAMs的分化依賴于Notch信號,但Kupffer細(xì)胞增殖成為TAMs不依賴于Notch信號。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1309825