發(fā)布時間：2017-12-16 07:21

  本文關鍵詞：FANCD2 shRNA干擾對頭頸鱗癌頸淋巴結轉移細胞HSC-4放療敏感性的影響和機制研究

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【摘要】：目的:頭頸部鱗狀細胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)是臨床上常見的惡性腫瘤。HNSCC特別是鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)98%屬于低分化鱗狀細胞癌,首選放射治療。然而,對于局部復發(fā),遠處轉移和初次治療失敗的患者單純放療療效較差,特異性高、靶向性強的放療增敏技術及方法急需研發(fā)。課題組前期實驗已經證明FANCD2 shRNA干擾沉默F(xiàn)ANCD2基因表達后可通過影響HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4的體外生長增殖、凋亡、細胞周期及相關蛋白的表達提高HSC-4細胞對順鉑的敏感性。但關于FANCD2基因是否參與了HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4對放射治療敏感性的調控尚不得而知。本研究以FANCD2 shRNA干擾獲得的FANCD2穩(wěn)定沉默HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4為研究對象,研究HSC-4細胞放療后細胞體外增殖抑制效應、凋亡率、細胞周期分布、存活率及相關蛋白表達的變化,探討沉默F(xiàn)ANCD2對HSC-4細胞放療敏感性的影響及可能機制。方法:以前期實驗獲得FANCD2沉默效應穩(wěn)定的HNSCC頸淋巴結轉移細胞HSC-4為研究對象,將實驗細胞分為三組,實驗組:FANCD2-shRNA(轉染含F(xiàn)ANCD2有效干擾序列且FANCD2沉默效應穩(wěn)定的HSC-4細胞),空白對照組:HSC-4(未經轉染的HSC-4細胞),陰性對照組:FANCD2-shRNA-C(轉染FANCD2無效干擾序列的HSC-4細胞)。三組細胞常規(guī)培養(yǎng),陰性對照組及實驗組培養(yǎng)過程中以嘌呤霉素篩選。通過細胞增殖抑制試驗(cellcountingkit-8,cck-8)檢測三組hsc-4細胞在不同劑量及不同作用時間鈷60照射后生長增殖的情況,流式細胞術(annexinv-fitc/pi染色法)測定三組hsc-4細胞鈷60照射后凋亡率和細胞周期改變,克隆形成法檢測三組hsc-4細胞放療后的存活率,以研究fancd2shrna干擾對hsc-4細胞放療敏感性的影響;通過westernblot法檢測fancd2shrna干擾以及放療后bax、bcl-2、p-38和p-p-38蛋白表達的變化,探討fancd2與bax、bcl-2、p-38和p-p-38蛋白表達的關系,研究fnacd2shrna干擾影響hsc-4細胞放療敏感性的可能機制。結果:(1)cck-8檢測結果顯示隨著放療劑量加大三組細胞增殖抑制率均提高,且實驗組在各劑量照射后的增殖抑制效應均強于對照組(p0.05),其中在放療劑量增加至8gy時實驗組吸光度值(od)(0.256±0.027)明顯低于陰性對照組(0.362±0.008)和空白對照組(0.382±0.0213),增殖抑制作用最強,組間比較差異有統(tǒng)計學意義(f=103.835,p0.05);照射劑量為5gy作用24、48、72小時后,三組細胞增殖水平均隨時間延長而降低,照射后24、48、72小時各細胞組間od值差異均有統(tǒng)計學意義,統(tǒng)計值分別為(f=6.307,p0.05)、(f=9.007,p0.05)和(f=22.914,p0.05),且實驗組增殖抑制效應較對照組更強;(2)流式細胞術檢測結果顯示8gy放射治療后細胞常規(guī)培養(yǎng)48小時,實驗組細胞凋亡率(34.074±0.061)%明顯高于陰性對照組(5.926±0.038)%和空白對照組(14.241±0.047)%,差異有統(tǒng)計學意義(f=261.786,p0.05),即說明shrna干擾沉默fnacd2后hsc-4細胞由放療誘導的凋亡率增加;(3)shrna干擾沉默fancd2后,三組細胞放射治療后48小時實驗組細胞周期變化為進入s期比例增加(f=160.778,p0.05),進入g0/g1期細胞減少(f=224.974,p0.05),g2/m期比例無明顯差異(f=2.664,p0.05),與陰性對照組及空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。(4)克隆形成實驗結果顯示隨著放療劑量加大,各組細胞存活率均降低且各組間差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05),放療劑量增加至8gy時shrna干擾組細胞存活率(0.007±0.021)較空白對照組(0.039±0.013)和陰性對照組(0.037±0.016)明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(f=10.671,p0.05)。(5)westernblot結果表明shrna干擾沉默fancd2表達后,實驗組細胞bax(f=931.591,p0.05)和p-p38(f=685.425,p0.05)蛋白表達較對照組增強,p-38(f=1954.140,p0.05)和bcl-2(f=3219.791,p0.05)蛋白表達降低;各組細胞放射治療后,實驗組bax(f=429.591,p0.05)和p-p38(f=214.974,p0.05)蛋白表達較對照組增強,p-38(f=1027.974,p0.05)和bcl-2(f=285.974,p0.05)蛋白表達較對照組降低。結論:(1)fancd2shrna干擾能提高人hnscc頸淋巴結轉移hsc-4細胞放療后的增殖抑制效應,促進細胞由放療誘導的凋亡,導致細胞周期阻滯,降低細胞存活率,即shrna干擾沉默fancd2表達能提高人hnscc頸淋巴結轉移細胞hsc-4對放射治療的敏感性;(2)fancd2基因沉默可能通過調節(jié)細胞凋亡相關通路bax/bcl-2蛋白的表達,促進hsc-4細胞放療誘導的凋亡,并通過激活p-38mapk通路,導致p-p-38蛋白表達增強,共同參與hsc-4細胞放射治療后細胞增殖,凋亡、細胞周期分布的調控從而提高人hnscc頸淋巴結轉移細胞hsc-4對放射治療的敏感性。(3)沉默fancd2表達有望為hnscc尤其是晚期發(fā)生頸部淋巴結轉移患者的治療帶來希望,同時為HNSCC患者的靶向治療提供新的思路。
【學位授予單位】：四川醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.91

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