本文關(guān)鍵詞：肝癌群體細(xì)胞3D培養(yǎng)模型的建立及其運(yùn)動(dòng)表型研究

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【摘要】：背景及目的:癌癥(cancer)是導(dǎo)致人類死亡的一個(gè)重要原因,每年全世界癌癥死亡的人數(shù)不斷增多,腫瘤惡性程度也在不斷提高。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在世界癌癥死亡率排名中排名第二位,其具有高轉(zhuǎn)移率,低預(yù)后率,難以治療等特點(diǎn)。腫瘤的惡性侵襲與轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致患者腫瘤復(fù)發(fā),治療效果不佳,預(yù)后效果比較差。腫瘤細(xì)胞一旦轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞,它的侵襲和遷移能力也會(huì)變得異常強(qiáng)大。腫瘤細(xì)胞并不只限于單個(gè)細(xì)胞的遷移。在許多腫瘤類型中,通常觀察到的侵襲單元是細(xì)胞群,群體的行為決定惡性功能。二維(two-dimensional,2D)細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究,但在二維水平生長的細(xì)胞并不能精確地模擬體內(nèi)的狀態(tài)。相比于二維細(xì)胞培養(yǎng)的情況下,三維(three-dimensiona,3D)細(xì)胞培養(yǎng)通過運(yùn)用再造細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)(比如Matrigel、collagen I等),能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞生存環(huán)境,為細(xì)胞提供一個(gè)更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境,更有利于開展腫瘤細(xì)胞向周圍組織侵襲和遷移的研究。HAb18G/CD147分子是一種跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族黏附因子。其具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞和周圍基質(zhì)成纖維細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs),以降解肝癌組織周圍細(xì)胞外基質(zhì)的作用,進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究發(fā)現(xiàn),HAb18G/CD147很有可能在肝癌群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用。盡管群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)概念很早就被提出來,但是,先前的研究重點(diǎn)都是群體細(xì)胞參與正常發(fā)育過程,包括原腸胚形成、腺管形成、血管形成、斑馬魚胚層發(fā)育中細(xì)胞的遷移等,在腫瘤中群體細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)的機(jī)制仍然不是很清楚。所以,明確肝癌群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的具體表型,更有助于開展CD147調(diào)控腫瘤群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的分子機(jī)制研究。方法:通過劃痕和transwell實(shí)驗(yàn),檢測三株人肝癌細(xì)胞遷移侵襲能力,免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測在2D和3D培養(yǎng)條件下肝癌細(xì)胞遷移侵襲關(guān)鍵分子表達(dá)情況。運(yùn)用Collagen I膠建立3D培養(yǎng)模型,將三株肝癌細(xì)胞系接種于膠原上,培養(yǎng)數(shù)天,石蠟包埋切片,HE染色方法評(píng)價(jià)模型建成情況�；诮⒌母伟┤后w細(xì)胞3D培養(yǎng)模型,運(yùn)用免疫熒光染色方法對(duì)肝癌群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)關(guān)鍵分子,如HAb18G/CD147,鈣黏蛋白E-cadherin,黏著斑Vinculin等分子的表達(dá)及分布情況進(jìn)行初步研究,同時(shí)選取肝癌臨床標(biāo)本,運(yùn)用HE染色方法,免疫組織化學(xué)染色方法對(duì)肝癌群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)關(guān)鍵分子的表達(dá)及分布情況進(jìn)行研究。結(jié)果:劃痕和transwell實(shí)驗(yàn)表明,三株人肝癌細(xì)胞都具有較強(qiáng)的遷移侵襲能力。免疫印跡實(shí)驗(yàn)提示,3D培養(yǎng)條件下的肝癌細(xì)胞遷移侵襲關(guān)鍵分子表達(dá)明顯高于2D培養(yǎng)條件。運(yùn)用3D培養(yǎng)模型培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞,經(jīng)石蠟包埋切片,HE染色觀察,發(fā)現(xiàn)三株肝癌細(xì)胞都能夠向Collagen I膠中生長侵襲,并呈現(xiàn)群體樣運(yùn)動(dòng)。運(yùn)用免疫熒光染色以及免疫組織化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)HAb18G/CD147分子在肝癌中高表達(dá),并且主要分布在細(xì)胞膜上。E-cadherin分子也高表達(dá)于肝癌,主要分布在肝癌細(xì)胞與細(xì)胞連接處。Paxillin高表達(dá)于肝癌細(xì)胞中,促進(jìn)黏著斑的形成。Vinculin分子在肝癌群體細(xì)胞中表現(xiàn)出極性分布,主要分布在群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前緣,為群體細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)提供強(qiáng)大的粘附力。FAK在肝癌組織和正常組織中都有表達(dá),但活化之后的FAK,即p-FAK高表達(dá)于肝癌細(xì)胞中。Vinculin在肝癌群體細(xì)胞中表現(xiàn)出極性分布,主要分布在群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前緣,為群體細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)提供強(qiáng)大的粘附力。Rac1主要分布在群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前緣,保證前緣細(xì)胞的突起形成。結(jié)論:成功建立肝癌群體細(xì)胞3D培養(yǎng)模型,通過運(yùn)用3D肝癌培養(yǎng)模型制作的標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光染色,以及肝癌臨床標(biāo)本免疫組織化學(xué)染色,對(duì)肝癌群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)關(guān)鍵分子進(jìn)行表達(dá)及分布分析,基本明確了肝癌群體細(xì)胞運(yùn)動(dòng)表型。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7
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本文編號(hào)：1283290