本文關(guān)鍵詞：Wentilactone A對小細(xì)胞肺癌增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制研究

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【摘要】：《2015年中國腫瘤登記年報(bào)》顯示,肺癌是我國死亡率最高的腫瘤。臨床-病理分型將肺癌分成小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。SCLC約占肺癌患者總數(shù)的15%,其特點(diǎn)為癌細(xì)胞生長快,擴(kuò)散轉(zhuǎn)移早,惡性程度高。耐藥問題導(dǎo)致SCLC患者死亡率和復(fù)發(fā)率高,5年生存率不足2%,因此開發(fā)療效好、副作用小的SCLC藥物具有十分重大的意義。Wentilactone A(WA)是一種從海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到的去甲二萜類小分子化合物。本課題組前期研究結(jié)果表明WA具有抑制SCLC細(xì)胞株NCI-H446增殖的生物學(xué)活性。本研究擬通過檢測WA對NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm三種SCLC細(xì)胞株增殖和凋亡的影響,采用人全基因組表達(dá)譜芯片篩選、基因功能獲得和干擾、Western Blot、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)分析WA作用的分子機(jī)制,希望能進(jìn)一步揭示W(wǎng)A抑制SCLC細(xì)胞株增殖的分子機(jī)制,為WA的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。第一部分Wentilactone A誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制SCLC增殖的研究為了研究WA對SCLC細(xì)胞株增殖的影響,本部分選取三株SCLC細(xì)胞株NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm為研究對象,通過Cell Counting Kit-8(CCK-8)實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot、裸鼠移植瘤模型等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:WA能強(qiáng)烈抑制SCLC細(xì)胞株NCI-H446、NCI-1688、LTEP-sm增殖,且抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:WA能誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞株NCI-H446、NCI-H1688、LTEP-sm凋亡,且具有時(shí)間依賴性。Western Blot結(jié)果表明:10μM WA作用后,三種SCLC細(xì)胞株中凋亡抑制蛋白c-FLIP表達(dá)都降低,凋亡蛋白c-caspase-3表達(dá)增加。裸鼠移植瘤模型結(jié)果表明:WA能抑制NCI-H446細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長。此外,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明WA還能能抑制這三種SCLC細(xì)胞株的遷移。綜上所述,體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明WA具有抑制SCLC細(xì)胞株增殖、遷移,誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞株凋亡的活性。第二部分Wentilactone A誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞株凋亡的分子機(jī)制研究為了進(jìn)一步研究WA誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞株凋亡,抑制SCLC細(xì)胞株增殖的分子機(jī)制,我們首先利用人類全基因表達(dá)譜芯片篩選出化合物WA處理前后差異表達(dá)的基因,Western Blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)基因芯片結(jié)果可靠。GO分析和Pathway分析結(jié)果提示:凋亡通路、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)等信號(hào)通路的基因表達(dá)情況在WA處理前后有顯著差異(P0.05),其中變化最明顯的基因是醛酮還原酶家族1成員C1(aldo-keto reductase family 1 member C1,AKR1C1)基因,下調(diào)倍數(shù)為94.74倍。因此推測AKR1C1基因可能是WA重要的效應(yīng)基因。WA具有抑制AKR1C1基因表達(dá)的作用。為了研究WA抑制AKR1C1基因表達(dá)、誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞株凋亡的生物學(xué)機(jī)制,我們開展了基因功能獲得和干擾實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot等實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:干擾AKR1C1基因后,三種SCLC細(xì)胞株凋亡率均增加。干擾AKR1C1基因后,NCI-H446裸鼠移植瘤生長速度變慢,與WA作用效果一致;相反,AKR1C1基因功能獲得后的NCI-H446裸鼠移植瘤生長速度變快,且過表達(dá)AKR1C1基因后,細(xì)胞凋亡率減少(P0.05)。我們進(jìn)一步地通過Western Blot實(shí)驗(yàn)研究WA抑制AKR1C1表達(dá)的信號(hào)通路,結(jié)果表明:10μM WA處理三株SCLC細(xì)胞株后,IGF-1R/IRS-1/PI3K/AKT/Nrf2蛋白的磷酸化水平均降低,同時(shí)AKR1C1表達(dá)量降低。用該信號(hào)通路激動(dòng)劑IGF-1 50 ng/ml處理細(xì)胞24h后,AKR1C1表達(dá)量升高,細(xì)胞凋亡率降低。與WA單處理相比,IGF-1和WA共處理細(xì)胞后,AKR1C1表達(dá)升高,細(xì)胞凋亡率下降。此結(jié)果表明IGF-1具有拮抗WA誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞株凋亡的作用。此外,免疫組化的結(jié)果也證實(shí)WA具有抑制AKR1C1表達(dá)的作用。上述研究結(jié)果表明WA抑制IGF-1R/IRS-1/PI3K/AKT/Nrf2通路蛋白的磷酸化,進(jìn)而抑制AKR1C1基因的表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞凋亡。通過本課題研究,我們得到以下了結(jié)論:(1)WA具有抑制SCLC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的作用;(2)AKR1C1基因參與WA抑制SCLC細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的過程;(3)WA通過抑制IGF-1R/IRS-1/PI3K/AKT/Nrf2通路蛋白的磷酸化,進(jìn)而抑制AKR1C1基因表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1270345