本文關鍵詞：Wnt信號通路在維持鼻咽癌SP細胞“干”性的機制研究

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【摘要】：背景鼻咽癌是東南亞及華南地區(qū)常見的高侵襲性的惡性腫瘤,在我國,尤其以廣東高發(fā),是嚴重影響人民健康的惡性腫瘤。目前鼻咽癌的病因及發(fā)病機制尚未完全清楚,其發(fā)生與遺傳、飲食習慣、EB病毒感染及環(huán)境等多種因素有關,男性發(fā)病風險較女性高,男女發(fā)病的性別比約2：1。雖然隨著對鼻咽癌的研究深入,目前主要治療方法是放射治療或以放射治療為主的綜合治療,并使大部分鼻咽癌患者獲得較好的短期療效,雖然如今調強放療方法能夠讓鼻咽癌患者五年生存率提高到65%-70%左右,但遠處轉移和局部復發(fā)成為治療失敗的主要原因,有文獻報道約55%的鼻咽癌病人在治療后5年出現(xiàn)了復發(fā)轉移,大量的臨床實踐表明,鼻咽癌對放療或化療抗拒是導致治療失敗主要因素之一。因此,為了提高鼻咽癌患者的五年生存率,必須通過科學的研究以尋找更為有效的治療技術,而尋找鼻咽癌的特異性腫瘤標志物或信號傳導通路可以為靶向藥物的研發(fā)提供幫助。近年來,腫瘤干細胞(CSC)理論提出并認為,腫瘤復發(fā)、轉移以及對治療的耐受等均與CSC相關,該理論提出了鼻咽癌難以治療成功的具體原因之所在。腫瘤干細胞指的是位于腫瘤組織里面,在不需要外界因素的作用下可以更新,并在分化的過程中釋放不同的異質性腫瘤細胞的細胞,它能夠進行無限增殖和多向分化,在腫瘤細胞中其數(shù)量很少,不過在更新和分化方面有著巨大的潛力,而且還表現(xiàn)出耐藥性、克隆形成能力以及腫瘤形成能力,提示與腫瘤的轉移復發(fā)有關。CSC和正常干細胞具有相似的自我更新機制,采取不對稱分裂的方式,即：一個CSC發(fā)生分裂后,就能夠得到全新的CSC以及另一個子細胞,值得注意的是,通過這種分裂方式得到的子細胞會自我分化,并轉變成為其他種類的細胞,包括腫瘤細胞。這種分類的結果是維持CSC數(shù)目的穩(wěn)定并形成腫瘤。如何在傳統(tǒng)治療方式的基礎上研究鼻咽癌干細胞,如特異性表面標志以及影響腫瘤干細胞的信號傳導路徑,從而尋求一種能夠從根本上消滅鼻咽癌腫瘤干細胞而降低腫瘤復發(fā)概率的治療手段,對提高鼻咽癌的五年生存率,具有重大意義。研究表明,在鼻咽癌細胞株中可以分離出側群細胞(side population cell, SP cell),它們是對骨髓造血干細胞進行分離的過程中,綜合應用DNA熒光燃料Hoechst33342以及流式細胞技術而首次探測到的細胞亞群,其具有自我更新、多向分化能力等一系列干細胞的生物學特征。有些學者指出,SP細胞屬于原始的干細胞或者至少二者之間存在非常緊密的關聯(lián),表現(xiàn)在側群細胞的自我更新、無限增值和強致瘤性等生物學行為特征方面,SP表型是各種來源的干細胞的普遍標志,因此SP細胞與CSC有很多共性,其可以富集CSC,對放化療也具有抵抗性,由于迄今為止對鼻咽癌SP細胞研究的報道不多,因為鼻咽癌以未分化的鱗狀細胞癌居多,本課題我們選用低分化的CNE-2細胞系作為研究的主要對象。從鼻咽癌CNE-2細胞系中分選出SP細胞,并研究其“干”性機制。健康機體的干細胞里面有一種Wnt/β-catenin信號轉導通路,該通路是細胞實現(xiàn)更新、分化、凋亡功能的重要依賴。另外,機體對沒有達到成熟的CSC的控制也離不開該通路,很多腫瘤的CSC里面都發(fā)現(xiàn)有Wnt/β-catenin信號轉導通路的存在,該通路使得細胞具有了耐藥性,并對腫瘤的復發(fā)進行介導,并且CSC干性的維持目前主要認為依靠Wnt/β-catenin信號轉導通路。腫瘤細胞Wnt/β-catenin信號通路異常改變的關鍵因素是P-catenin降解障礙導致胞漿內游離的β-catenin聚集并與TCF/LEF結合進入細胞核內,啟動下游基因轉錄。由于β-catenin的異常是鼻咽癌發(fā)生的常見事件,有研究表明其對鼻咽癌CSC特性的發(fā)揮過程而言是不可或缺的�，F(xiàn)有的研究結論表明,Wnt/β-catenin信號通路對于SP細胞的增殖和分化也具有重要意義,但是Wnt/β-catenin信號通路在鼻咽癌SP細胞的作用機制研究卻鮮有報導。惡性腫瘤的轉移途徑主要為三種,分別是種植轉移、淋巴道轉移以及血道轉移,其中以淋巴道及血道轉移為主要轉移方式,這是一個十分復雜的多階段連續(xù)的過程。腫瘤細胞是按照如下步驟進行轉移的：腫瘤細胞開始浸潤和發(fā)育,附著在基底膜上并尋求突破,從內皮細胞貫穿而入,并進入到血液循環(huán)系統(tǒng)里面,一旦到達靶器官組織上的血管部位后,就會停留,然后從停留部位的內皮細胞穿透出去,靶器官上就會出現(xiàn)轉移灶。而在侵襲和轉移的過程中,腫瘤細胞與血管內皮細胞的粘附是轉移的決定性步驟之一。根據目前的研究成果,無論是腫瘤細胞附著在基底膜或其他細胞上,還是其自身的生長變化,都需要某種糖蛋白分子發(fā)揮作用,CD44基因表達后的產物是這種糖蛋白分子之一。它是腫瘤干細胞特異性表面標志物之一,其已確定為乳腺癌、胰腺癌、腸癌,頭頸部鱗狀細胞癌的CSC特異性表面標志物。鼻咽癌與頭頸部其它鱗癌的病理類型一致和部位相近,使我們有理由推測CD44也可能也是鼻咽癌的特異性表面標志物。由于CSC干性的維持目前主要認為依靠Wnt/β-catenin信號轉導通路,并且CD44又是Wnt/β-catenin信號通路下游區(qū)的靶基因,因此研究CD44的表達情況和CD44+SP細胞特性,對尋找鼻咽癌CSC以及如何抑制Wnt/β-catenin信號轉導通路異常,達到改變該類CSC特性或殺滅該CSC,為制造抗鼻咽癌新藥物或治療方法提供前提。通過干擾Wnt/β-catenin信號通路以期改變或殺滅腫瘤干細胞的研究不多,一般認為可考慮通過小分子抑制物(siRNA)或者生物抑制物來阻斷Wnt/β-catenin信號通路異常以改變腫瘤干細胞特性達到治療目的,目前尚未見有關通過干擾Wnt/β-catenin信號通路對鼻咽癌側群細胞的影響的報道。因此本課題旨在從鼻咽癌CNE-2細胞中分選出SP細胞,并從SP細胞中再分選出CD44+細胞,研究鼻咽癌SP細胞中Wnt/β-catenin信號轉導通路以及其下游靶基因CD44表達情況和CD44+SP細胞的體外生物學特性,了解Wnt/p-catenin信號通路在鼻咽癌SP細胞“干”性的機制研究,有利于尋找在效果方面表現(xiàn)更為突出,能夠消滅鼻咽癌干細胞并將降低鼻咽癌復發(fā)率的全新治療手段。本課題研究的主要內容為：(1)從人鼻咽癌細胞株低分化細胞系(CNE-2)中分選出SP細胞并培養(yǎng);(2)從CNE-2 SP細胞中分選出CD44+SP細胞并培養(yǎng)；(3)檢驗CD44在鼻咽癌SP和NSP細胞的表達情況；(4)CNE-2細胞、CD44+SP細胞與CD44-SP細胞不同生物學行為的檢測,包括體外培養(yǎng)的細胞生長率、遷移實驗、平板克隆形成實驗、細胞周期分析及對化療藥物的敏感性等實驗；(5)通過轉染β-catenin siRNA阻斷Wnt/β-catenin信號轉導通路,轉染了β-catenin siRNA的細胞系中CNE-2細胞及CD44+SP細胞數(shù)量檢測及生物學行為觀察,包括體外培養(yǎng)的細胞生長率、遷移實驗、平板克隆形成實驗、細胞周期分析及對化療藥物的敏感性等實驗。第一章CD44在鼻咽癌SP細胞中的表達及其意義目的本研究探討CD44在人鼻咽癌SP細胞中的表達狀況及其生物學意義。方法采用流式細胞儀對培養(yǎng)的人鼻咽癌CNE-2細胞進行分選以獲得出CD44-SP細胞及CD44+SP細胞,通過細胞遷移實驗、平板克隆形成實驗、細胞周期分析及對化療藥物的敏感性等實驗,統(tǒng)計分析CNE-2、CNE-2 SP、CNE-2 NSP、CNE-2 CD44+SP、CNE-2 CD44-SP各細胞之間的生物學差異。結果鼻咽癌CNE-2細胞中可以提取到2.3% SP細胞,其中36.5%的CD44+SP細胞。CD44+SP細胞的增殖能力、細胞遷移能力、平板克隆形成能力均顯著高于其他細胞(P0.05),對化療藥物的耐受性顯著高于其他細胞(P0.05)。結論鼻咽癌細胞是由不同的細胞所構成的,SP細胞就是其中之一,不過這種細胞的數(shù)量并不多,其分化能力很強,能夠發(fā)展成為腫瘤細胞。由于CD44+SP細胞在鼻咽癌增殖生長以及化療耐藥方面起著重要作用,提示CD44可能可以作為鼻咽癌SP細胞表面的標志物之一。第二章Wnt/β-catenin信號通路調控下游基因CD44對鼻咽癌SP細胞中作用和意義目的Wnt/β-catenin信號通路在多種腫瘤中異常表達,CD44被證實為多種惡性腫瘤干細胞特異性表面標志物之一,本研究通過干擾Wnt/β-catenin信號通路,探討Wnt/β-catenin信號通路調控下游基因CD44對鼻咽癌SP細胞的作用和意義。方法從鼻咽癌CNE-2細胞株中分離SP細胞及CD44+SP細胞培養(yǎng)及鑒定,阻斷Wnt/p-catenin信號通路,了解CNE-2及CD44+SP細胞在體外的數(shù)量及生物學特性改變情況。結果鼻咽癌CNE-2細胞中可以提取到2.3% SP細胞,其中CD44+細胞占SP細胞的36.5%。CD44+SP細胞的體外增殖能力及對化療藥物的耐受性顯著高于其他細胞(P0.05),分別比較β-Catenin siRNA轉染前后的CNE-2及CD44+SP細胞,各組細胞經轉染后的增殖能力及克隆能力顯著下降,而對化療藥物的耐受能力卻顯著增強,各組轉染前后比較均具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。結論Wnt/β-catenin信號通路的異常與鼻咽癌CD44+SP細胞的生物學意義密切相關,干擾此通路可以改變鼻咽癌腫瘤干細胞特性。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63

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