本文關(guān)鍵詞：Wnt信號通路在維持鼻咽癌SP細(xì)胞“干”性的機制研究

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【摘要】：背景鼻咽癌是東南亞及華南地區(qū)常見的高侵襲性的惡性腫瘤,在我國,尤其以廣東高發(fā),是嚴(yán)重影響人民健康的惡性腫瘤。目前鼻咽癌的病因及發(fā)病機制尚未完全清楚,其發(fā)生與遺傳、飲食習(xí)慣、EB病毒感染及環(huán)境等多種因素有關(guān),男性發(fā)病風(fēng)險較女性高,男女發(fā)病的性別比約2：1。雖然隨著對鼻咽癌的研究深入,目前主要治療方法是放射治療或以放射治療為主的綜合治療,并使大部分鼻咽癌患者獲得較好的短期療效,雖然如今調(diào)強放療方法能夠讓鼻咽癌患者五年生存率提高到65%-70%左右,但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)成為治療失敗的主要原因,有文獻(xiàn)報道約55%的鼻咽癌病人在治療后5年出現(xiàn)了復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,大量的臨床實踐表明,鼻咽癌對放療或化療抗拒是導(dǎo)致治療失敗主要因素之一。因此,為了提高鼻咽癌患者的五年生存率,必須通過科學(xué)的研究以尋找更為有效的治療技術(shù),而尋找鼻咽癌的特異性腫瘤標(biāo)志物或信號傳導(dǎo)通路可以為靶向藥物的研發(fā)提供幫助。近年來,腫瘤干細(xì)胞(CSC)理論提出并認(rèn)為,腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及對治療的耐受等均與CSC相關(guān),該理論提出了鼻咽癌難以治療成功的具體原因之所在。腫瘤干細(xì)胞指的是位于腫瘤組織里面,在不需要外界因素的作用下可以更新,并在分化的過程中釋放不同的異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞,它能夠進(jìn)行無限增殖和多向分化,在腫瘤細(xì)胞中其數(shù)量很少,不過在更新和分化方面有著巨大的潛力,而且還表現(xiàn)出耐藥性、克隆形成能力以及腫瘤形成能力,提示與腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)。CSC和正常干細(xì)胞具有相似的自我更新機制,采取不對稱分裂的方式,即：一個CSC發(fā)生分裂后,就能夠得到全新的CSC以及另一個子細(xì)胞,值得注意的是,通過這種分裂方式得到的子細(xì)胞會自我分化,并轉(zhuǎn)變成為其他種類的細(xì)胞,包括腫瘤細(xì)胞。這種分類的結(jié)果是維持CSC數(shù)目的穩(wěn)定并形成腫瘤。如何在傳統(tǒng)治療方式的基礎(chǔ)上研究鼻咽癌干細(xì)胞,如特異性表面標(biāo)志以及影響腫瘤干細(xì)胞的信號傳導(dǎo)路徑,從而尋求一種能夠從根本上消滅鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞而降低腫瘤復(fù)發(fā)概率的治療手段,對提高鼻咽癌的五年生存率,具有重大意義。研究表明,在鼻咽癌細(xì)胞株中可以分離出側(cè)群細(xì)胞(side population cell, SP cell),它們是對骨髓造血干細(xì)胞進(jìn)行分離的過程中,綜合應(yīng)用DNA熒光燃料Hoechst33342以及流式細(xì)胞技術(shù)而首次探測到的細(xì)胞亞群,其具有自我更新、多向分化能力等一系列干細(xì)胞的生物學(xué)特征。有些學(xué)者指出,SP細(xì)胞屬于原始的干細(xì)胞或者至少二者之間存在非常緊密的關(guān)聯(lián),表現(xiàn)在側(cè)群細(xì)胞的自我更新、無限增值和強致瘤性等生物學(xué)行為特征方面,SP表型是各種來源的干細(xì)胞的普遍標(biāo)志,因此SP細(xì)胞與CSC有很多共性,其可以富集CSC,對放化療也具有抵抗性,由于迄今為止對鼻咽癌SP細(xì)胞研究的報道不多,因為鼻咽癌以未分化的鱗狀細(xì)胞癌居多,本課題我們選用低分化的CNE-2細(xì)胞系作為研究的主要對象。從鼻咽癌CNE-2細(xì)胞系中分選出SP細(xì)胞,并研究其“干”性機制。健康機體的干細(xì)胞里面有一種Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,該通路是細(xì)胞實現(xiàn)更新、分化、凋亡功能的重要依賴。另外,機體對沒有達(dá)到成熟的CSC的控制也離不開該通路,很多腫瘤的CSC里面都發(fā)現(xiàn)有Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的存在,該通路使得細(xì)胞具有了耐藥性,并對腫瘤的復(fù)發(fā)進(jìn)行介導(dǎo),并且CSC干性的維持目前主要認(rèn)為依靠Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。腫瘤細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路異常改變的關(guān)鍵因素是P-catenin降解障礙導(dǎo)致胞漿內(nèi)游離的β-catenin聚集并與TCF/LEF結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),啟動下游基因轉(zhuǎn)錄。由于β-catenin的異常是鼻咽癌發(fā)生的常見事件,有研究表明其對鼻咽癌CSC特性的發(fā)揮過程而言是不可或缺的�，F(xiàn)有的研究結(jié)論表明,Wnt/β-catenin信號通路對于SP細(xì)胞的增殖和分化也具有重要意義,但是Wnt/β-catenin信號通路在鼻咽癌SP細(xì)胞的作用機制研究卻鮮有報導(dǎo)。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移途徑主要為三種,分別是種植轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移以及血道轉(zhuǎn)移,其中以淋巴道及血道轉(zhuǎn)移為主要轉(zhuǎn)移方式,這是一個十分復(fù)雜的多階段連續(xù)的過程。腫瘤細(xì)胞是按照如下步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)移的：腫瘤細(xì)胞開始浸潤和發(fā)育,附著在基底膜上并尋求突破,從內(nèi)皮細(xì)胞貫穿而入,并進(jìn)入到血液循環(huán)系統(tǒng)里面,一旦到達(dá)靶器官組織上的血管部位后,就會停留,然后從停留部位的內(nèi)皮細(xì)胞穿透出去,靶器官上就會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。而在侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中,腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是轉(zhuǎn)移的決定性步驟之一。根據(jù)目前的研究成果,無論是腫瘤細(xì)胞附著在基底膜或其他細(xì)胞上,還是其自身的生長變化,都需要某種糖蛋白分子發(fā)揮作用,CD44基因表達(dá)后的產(chǎn)物是這種糖蛋白分子之一。它是腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物之一,其已確定為乳腺癌、胰腺癌、腸癌,頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的CSC特異性表面標(biāo)志物。鼻咽癌與頭頸部其它鱗癌的病理類型一致和部位相近,使我們有理由推測CD44也可能也是鼻咽癌的特異性表面標(biāo)志物。由于CSC干性的維持目前主要認(rèn)為依靠Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,并且CD44又是Wnt/β-catenin信號通路下游區(qū)的靶基因,因此研究CD44的表達(dá)情況和CD44+SP細(xì)胞特性,對尋找鼻咽癌CSC以及如何抑制Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常,達(dá)到改變該類CSC特性或殺滅該CSC,為制造抗鼻咽癌新藥物或治療方法提供前提。通過干擾Wnt/β-catenin信號通路以期改變或殺滅腫瘤干細(xì)胞的研究不多,一般認(rèn)為可考慮通過小分子抑制物(siRNA)或者生物抑制物來阻斷Wnt/β-catenin信號通路異常以改變腫瘤干細(xì)胞特性達(dá)到治療目的,目前尚未見有關(guān)通過干擾Wnt/β-catenin信號通路對鼻咽癌側(cè)群細(xì)胞的影響的報道。因此本課題旨在從鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中分選出SP細(xì)胞,并從SP細(xì)胞中再分選出CD44+細(xì)胞,研究鼻咽癌SP細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及其下游靶基因CD44表達(dá)情況和CD44+SP細(xì)胞的體外生物學(xué)特性,了解Wnt/p-catenin信號通路在鼻咽癌SP細(xì)胞“干”性的機制研究,有利于尋找在效果方面表現(xiàn)更為突出,能夠消滅鼻咽癌干細(xì)胞并將降低鼻咽癌復(fù)發(fā)率的全新治療手段。本課題研究的主要內(nèi)容為：(1)從人鼻咽癌細(xì)胞株低分化細(xì)胞系(CNE-2)中分選出SP細(xì)胞并培養(yǎng);(2)從CNE-2 SP細(xì)胞中分選出CD44+SP細(xì)胞并培養(yǎng)；(3)檢驗CD44在鼻咽癌SP和NSP細(xì)胞的表達(dá)情況；(4)CNE-2細(xì)胞、CD44+SP細(xì)胞與CD44-SP細(xì)胞不同生物學(xué)行為的檢測,包括體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長率、遷移實驗、平板克隆形成實驗、細(xì)胞周期分析及對化療藥物的敏感性等實驗；(5)通過轉(zhuǎn)染β-catenin siRNA阻斷Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,轉(zhuǎn)染了β-catenin siRNA的細(xì)胞系中CNE-2細(xì)胞及CD44+SP細(xì)胞數(shù)量檢測及生物學(xué)行為觀察,包括體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長率、遷移實驗、平板克隆形成實驗、細(xì)胞周期分析及對化療藥物的敏感性等實驗。第一章CD44在鼻咽癌SP細(xì)胞中的表達(dá)及其意義目的本研究探討CD44在人鼻咽癌SP細(xì)胞中的表達(dá)狀況及其生物學(xué)意義。方法采用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)的人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞進(jìn)行分選以獲得出CD44-SP細(xì)胞及CD44+SP細(xì)胞,通過細(xì)胞遷移實驗、平板克隆形成實驗、細(xì)胞周期分析及對化療藥物的敏感性等實驗,統(tǒng)計分析CNE-2、CNE-2 SP、CNE-2 NSP、CNE-2 CD44+SP、CNE-2 CD44-SP各細(xì)胞之間的生物學(xué)差異。結(jié)果鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中可以提取到2.3% SP細(xì)胞,其中36.5%的CD44+SP細(xì)胞。CD44+SP細(xì)胞的增殖能力、細(xì)胞遷移能力、平板克隆形成能力均顯著高于其他細(xì)胞(P0.05),對化療藥物的耐受性顯著高于其他細(xì)胞(P0.05)。結(jié)論鼻咽癌細(xì)胞是由不同的細(xì)胞所構(gòu)成的,SP細(xì)胞就是其中之一,不過這種細(xì)胞的數(shù)量并不多,其分化能力很強,能夠發(fā)展成為腫瘤細(xì)胞。由于CD44+SP細(xì)胞在鼻咽癌增殖生長以及化療耐藥方面起著重要作用,提示CD44可能可以作為鼻咽癌SP細(xì)胞表面的標(biāo)志物之一。第二章Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控下游基因CD44對鼻咽癌SP細(xì)胞中作用和意義目的Wnt/β-catenin信號通路在多種腫瘤中異常表達(dá),CD44被證實為多種惡性腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物之一,本研究通過干擾Wnt/β-catenin信號通路,探討Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控下游基因CD44對鼻咽癌SP細(xì)胞的作用和意義。方法從鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株中分離SP細(xì)胞及CD44+SP細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定,阻斷Wnt/p-catenin信號通路,了解CNE-2及CD44+SP細(xì)胞在體外的數(shù)量及生物學(xué)特性改變情況。結(jié)果鼻咽癌CNE-2細(xì)胞中可以提取到2.3% SP細(xì)胞,其中CD44+細(xì)胞占SP細(xì)胞的36.5%。CD44+SP細(xì)胞的體外增殖能力及對化療藥物的耐受性顯著高于其他細(xì)胞(P0.05),分別比較β-Catenin siRNA轉(zhuǎn)染前后的CNE-2及CD44+SP細(xì)胞,各組細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后的增殖能力及克隆能力顯著下降,而對化療藥物的耐受能力卻顯著增強,各組轉(zhuǎn)染前后比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論Wnt/β-catenin信號通路的異常與鼻咽癌CD44+SP細(xì)胞的生物學(xué)意義密切相關(guān),干擾此通路可以改變鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞特性。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.63

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本文編號：1258266