本文關(guān)鍵詞：靶向程序性死亡因子配體1的新型免疫細(xì)胞因子的制備及抗腫瘤功能研究

  更多相關(guān)文章： 抗PD-L1單抗 免疫細(xì)胞因子 靶向治療 IL-2

【摘要】：目的:靶向PD-L1的單抗具有免疫激活功能,并已顯示出對多種腫瘤的良好治療效果。其主要作用原理是通過阻止腫瘤細(xì)胞表面PD-L1分子與T細(xì)胞表面PD-1分子的結(jié)合,從而解除其對T細(xì)胞的抑制作用,增強(qiáng)抗腫瘤免疫效應(yīng)。但由于臨床上某些腫瘤細(xì)胞表面PD-L1低表達(dá),應(yīng)用抗PD-L1單抗治療的療效較差,病情易反復(fù)。因此需要開發(fā)新型抗腫瘤免疫制劑來提高單抗療效,改善腫瘤愈后。IL-2因能激活體內(nèi)多種免疫細(xì)胞而可以用來治療腫瘤和炎癥性疾病。但由于其受體廣泛表達(dá),系統(tǒng)性應(yīng)用IL-2會引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此,我們采用基因工程技術(shù),將靶向PD-L1抗體的Fc段與IL-2分子融合,構(gòu)建新型重組免疫細(xì)胞因子。其目的是使之能特異性靶向腫瘤區(qū)域,避免非特異性結(jié)合導(dǎo)致的的血管毒性;同時阻斷PD-1/PD-L1結(jié)合,使機(jī)體的適應(yīng)性免疫協(xié)同特異性免疫,激活T細(xì)胞,B細(xì)胞等多種淋巴細(xì)胞,釋放細(xì)胞因子,以期達(dá)到對抗原表達(dá)量低,單用抗體效果不明顯腫瘤的更好治療效果。方法:首先,利用全基因合成技術(shù)將抗PD-L1單抗的IgG1亞類抗體的Fc重鏈基因通過linker與突變后的IL-2基因融合,連接至表達(dá)載體pc3.1DNA,構(gòu)建重鏈質(zhì)粒。MPDL3280單抗的可變區(qū)基因連接至表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建輕鏈質(zhì)粒,并與重鏈質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過細(xì)胞批次培養(yǎng),純化上清得到新型重組免疫細(xì)胞因子,簡稱BIPI。利用以下手段對其進(jìn)行表征鑒定:SDS-PAGE分析其分子量;FCM測定BIPI的親和力和抗原結(jié)合力;體外檢測其對小鼠T淋巴細(xì)胞系CTLL-2細(xì)胞的促增殖作用;在小鼠的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌預(yù)防性腫瘤模型中評估其抑瘤活性,并在治療過程中監(jiān)測小鼠體重,評估BIPI的安全性;利用抗體消除小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的CD8+T細(xì)胞,驗(yàn)證其在抑瘤過程中的作用;最后分離各治療組小鼠脾細(xì)胞,用磁珠法從混合細(xì)胞中分離得到CD8+T細(xì)胞,測定并比較各組間CD8+T細(xì)胞數(shù)量上的差異和其IFN-γ分泌量的不同,驗(yàn)證BIPI對體內(nèi)免疫系統(tǒng)的激活作用并分析免疫細(xì)胞因子的作用機(jī)制。結(jié)果:我們獲得了新型免疫細(xì)胞因子,經(jīng)分析其純度大于99%。經(jīng)SDS-PAGE、FCM等試驗(yàn)證實(shí)BIPI結(jié)構(gòu)正確并且與抗原有較好的結(jié)合活性。體外實(shí)驗(yàn)中,含有與IL-2同等摩爾質(zhì)量的BIPI與IL-2標(biāo)準(zhǔn)品有幾乎相同的促進(jìn)CTLL-2細(xì)胞生長的效能。在弱表達(dá)PD-L1的CT26轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌小鼠模型上,與對照組相比顯著減少了肺表面腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量,證實(shí)了免疫細(xì)胞因子BIPI的抑瘤活性。在后續(xù)對其抑瘤機(jī)制研究的過程中發(fā)現(xiàn),CD8+T細(xì)胞在BIPI的抑瘤效果發(fā)揮上有重要作用;消除CD8+T細(xì)胞后,小鼠的生存期顯著縮短,并且生存狀態(tài)不佳。在治療結(jié)束后,將CD8+T細(xì)胞分離后培養(yǎng),檢測其IFN-γ分泌量,結(jié)果顯示BIPI治療組顯著高于其他對照組,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。在體重監(jiān)測過程中各組小鼠體重均未發(fā)生異常改變,說明治療性藥物并未對小鼠產(chǎn)生明顯毒性,提示其安全性良好。結(jié)論:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí),我們所構(gòu)建的新型重組免疫細(xì)胞因子BIPI具有較好的抑瘤活性,尤其針對PD-L1弱表達(dá)的腫瘤類型,達(dá)到激活體內(nèi)淋巴細(xì)胞,促進(jìn)細(xì)胞因子分泌的作用。有望將來在臨床上應(yīng)用于PD-L1低表達(dá)腫瘤,彌補(bǔ)由于抗原結(jié)合不足導(dǎo)致的單抗藥物療效差,易復(fù)發(fā)等問題。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.51

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本文編號：1237854