本文關(guān)鍵詞：一碳單位代謝相關(guān)維生素與MGMT基因甲基化在食管癌發(fā)生中的作用研究

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【摘要】：目的：在江蘇淮安食管癌高發(fā)地區(qū)開展病例對照研究,探討06-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransf erase, MGMT)基因啟動子區(qū)甲基化在食管癌發(fā)生中的作用及其與葉酸和一碳單位代謝相關(guān)B族維生素的交互作用,并通過體外細(xì)胞實驗觀察AFB1對人類食管正常上皮細(xì)胞活性、細(xì)胞周期和凋亡及MGMT基因啟動子區(qū)甲基化的影響,同時驗證葉酸及相關(guān)B族維生素的干預(yù)作用,分析相關(guān)B族維生素,MGMT基因啟動子區(qū)甲基化與食管癌及癌前病變之間的關(guān)系,提供其與食管癌及癌前病變之間更直接的證據(jù),以期尋找食管癌診斷的有效分子生物學(xué)指標(biāo),為早診早治,和食管癌的早期營養(yǎng)學(xué)預(yù)防提供一定的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。方法：(1)在淮安食管癌高發(fā)區(qū)按性別、年齡±2歲為條件配對收集食管癌、癌前病變及健康人各220例,收集食管癌患者、食管癌前病變患者和正常對照人群的血液樣本,提取DNA,采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific pcr,MSP)方法對樣本進(jìn)行甲基化測定(2)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清葉酸、VB2、VB6、VB12含量并比較食管癌組、癌前病變組和正常對照組血清葉酸、VB2、VB6、VB12的差異。將三組間差異有顯著性的維生素含量按正常對照組四分位數(shù)分為四個等級,并將環(huán)境及飲食等危險因素暴露頻率賦值,采用多項Logistic回歸分析不同血清維生素含量水平環(huán)境及飲食因素與MGMT基因啟動子區(qū)甲基化水平之間的交互作用。(3)利用四甲基氮唑藍(lán)(MethylThiazolyl Tetrazolium,MTT)法測定AFB1對人食管正常上皮細(xì)胞HEEPiC增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況；MSP法檢測細(xì)胞MGMT基因啟動子區(qū)甲基化的水平。(4)采用葉酸、葉酸+維生素B2、葉酸+維生素B6、葉酸+維生素B12干預(yù)AFB1處理的人類正常食管上皮細(xì)胞,MTT法檢測細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況,雜交芯片法定量檢測細(xì)胞MGMT基因啟動子區(qū)甲基化的水平。結(jié)果：(1)在食管癌組、食管癌前組、正常組人群中,MGMT基因啟動子區(qū)甲基化率分別為37.3%(82/220)、19.1%(41/220)和3.8%(8/220)。MGMT基因DNA甲基化率在對照組、食管癌前病變組與食管癌組三組間差異有顯著性,具有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=26.90,P0.001)。單因素logistic回歸檢驗結(jié)果表明MGMT基因啟動子區(qū)甲基化是食管癌前病變和食管癌發(fā)生的危險因素(ORs=7.58、11.65)(2)血清維生素B2水平、血清維生素B12水平與MGMT基因甲基化對食管癌和癌前病變的發(fā)生沒有交互作用。血清葉酸水平和MGMT基因甲基化對食管癌和癌前病變的發(fā)生存在交互作用(P0.05)。血清葉酸第二四分位與最低四分位比較,可減少M(fèi)GMT基因啟動子區(qū)非甲基化者發(fā)生食管癌前病變及食管癌的風(fēng)險(P0.05)。當(dāng)血清葉酸水平較高時(26.92),可減少M(fèi)GMT基因甲基化和非甲基化者發(fā)生食管癌及食管癌前病變的風(fēng)險(P0.05)。血清維生素B6水平和MGMT基因甲基化對食管癌和癌前病變的發(fā)生存在交互作用(P0.05)。當(dāng)血清維生素B6水平在最低四分位時MGMT基因甲基化者較非甲基化者發(fā)生癌前病變以及患食管癌的風(fēng)險增加(P0.05)。血清維生素B6最高四分位與最低四分位相比,MGMT基因甲基化與非甲基化者發(fā)生食管癌前病變的風(fēng)險都增加OR值分別為2.024和2.771。食用油白菜、腌制食品與MGMT基因啟動子區(qū)甲基化對食管癌發(fā)生有交互作用。(3)用0.2μg/mL、0.4μg/mL、 0.8μg/mL、1.6μg/mL、2μg/mLAFB,處理人類正常食管上皮細(xì)胞24h、48h、72h,均可以抑制細(xì)胞增殖。0.8μg/mL、1.6μg/mL、2μg/mL AFB處理48h時,G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于陰性對照組(p0.05); 0.4μg/mL、0.8μg/mL、1.6μg/mL、2μg/mL AFB,處理S期細(xì)胞比例明顯高于陰性對照組(p0.05),細(xì)胞被阻滯在S期；同時1.6μg/mL、2μg/mLAFB處理48h時G2/M期細(xì)胞比例明顯高于陰性對照組(p0.05),細(xì)胞也被阻滯在G2/M期。AFB1分別在0.4μg/mL,0.8μg/mL,1.6μg/mL和2μg/mL的劑量時細(xì)胞凋亡比例與陰性對照組比較有顯著性差異(p0.05),可促進(jìn)人類正常食管上皮細(xì)胞凋亡。2μg/mL AFB,處理的細(xì)胞出現(xiàn)MGMT基因啟動子區(qū)甲基化,其余各劑量組未出現(xiàn)甲基化。(4)幾種B族維生素干預(yù)后可改善黃曲霉毒素抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗,各處理組細(xì)胞抑制率明顯低于染毒對照組(p0.05)。AFB1處理48h時,染毒對照組G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于正常對照組,S期,G2/M期細(xì)胞比例明顯高于正常對照組,細(xì)胞被阻滯在S期和G2/M期：而幾種B族維生素干預(yù)后S期細(xì)胞比例明顯低于染毒對照組；除葉酸+B6組,其他各干預(yù)組G2/M期細(xì)胞比例明顯低于染毒對照組,減少了S期和G2/M期的阻滯。同時幾種B族維生素干預(yù)組的細(xì)胞凋亡比例明顯低于染毒對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。甲基化定量檢測結(jié)果顯示葉酸及一碳單位代謝相關(guān)B族維生素組CpG14-15位點甲基化率明顯低于染毒對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論：食管癌和癌前病變的發(fā)生發(fā)展與MGMT基因啟動子區(qū)甲基化有關(guān),并與葉酸等血清B族維生素存在一定交互作用。體外細(xì)胞實驗結(jié)果表明,AFB1能夠抑制人正常食管上皮細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期,導(dǎo)致S期和G2/M期阻滯,并導(dǎo)致MGMT基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化。為了進(jìn)一步研究體外細(xì)胞實驗中葉酸等B族維生素與MGMT基因啟動子區(qū)甲基化的交互作用,進(jìn)行了干預(yù)實驗,結(jié)果表明葉酸等B族維生素能抑制AFB,的抑制細(xì)胞增殖作用,明顯改善AFB1對細(xì)胞周期S期的阻滯,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入G2/M期,阻滯AFB1促進(jìn)人類正常食管上皮細(xì)胞凋亡的作用,并減輕MGMT基因啟動子區(qū)甲基化的程度。體外干預(yù)實驗結(jié)果為進(jìn)一步研究黃曲霉毒素對人正常食管的作用及機(jī)制及葉酸等一碳單位代謝相關(guān)B族維生素的保護(hù)作用提供了研究基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1

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本文編號：1212331